Mecanotransducción celular. Correlación entre las propiedades mecánicas y la organización-dinámica de proteínas de adhesión focal en células vivas
Las células pueden detectar, generar y responder a un amplio rango de señalesexternas, químicas y físicas, integrar y analizar esta información y, en consecuencia,cambiar su morfología, dinámica, comportamiento y, eventualmente, destino. A nivelcelular, las respuestas biológicas a fuerzas externas se originan en dos tipos deestructuras especializadas: adhesiones focales (célula-matriz extracelular) y unionesadherentes (célula-célula). Las adhesiones focales son complejos de proteínasdispuestos en ensamblados multi-moleculares que unen la matriz extracelular, a travésde receptores integrales de membrana, a componentes del citoesqueleto. Estos sitiosde adhesión son estructuras planas, alargadas de unos pocos micrones cuadradosque a menudo están localizadas en la periferia de las células, y que ademásfuncionarían como organelas de señalización en el proceso de mecanotransduccióncelular. Uno de los retos que se presenta para estudiar el sistema es el de poderintegrar y combinar distintas técnicas que nos permitan analizar la dinámicaintracelular, la biomecánica de la célula/sustrato, detección de las fuerzas generadasen/por la célula, y observar la respuesta global de la célula en las distintascondiciones. Entonces, el estudio de la estructura, mecánica y dinámica de lasproteínas de adhesiones focales en respuesta a un estímulo mecánico en células vivasrequiere de técnicas que permitan visualizar y caracterizar en forma integrada ladinámica de eventos localizados en la célula. Estos métodos deben contar con unaresolución espacio-temporal alta, de forma tal que permitan detectar eventostransientes y altamente localizados. En este contexto, se han implementado, en estetrabajo de Tesis, distintas microscopías y espectroscopías de alta resolución espacialy temporal, en combinación con técnicas de biología molecular y celular. Con el objetivo de caracterizar las propiedades mecánicas de sustratos y células, enuna primera etapa se implementó un modo de operación avanzado en microscopía defuerza atómica (AFM), denominado PF-QNM (del inglés, Peak Force Quantitative Nanomechanical Property Mapping). Este modo permite obtener simultáneamente laimagen de topografía, junto con los mapas cuantitativos sobre las propiedades deelasticidad, adhesión, dureza, disipación de energía y deformación superficial. Seutilizaron sistemas modelo con distintas propiedades mecánicas de manera tal decubrir el amplio rango que va desde GPa a kPa, y estudiar las propiedades desustratos (vidrio, membranas de silicona y geles de poliacrilamina), así también comola línea celular utilizada en la Tesis. A nivel de adhesión focal, la estrategia fue transfectar células de epitelio mamario deratón (HC11), con proteínas componentes de la adhesión (por ejemplo, zixina, FAK,vinculina, paxilina) fusionadas a proteínas fluorescentes visibles. De esta forma,empleando microscopías y espectroscopías de fluorescencia, es posible visualizar laexpresión de las proteínas, registrar su localización y evolución en el tiempo y,mediante diferentes análisis, extraer información cuantitativa de dinámica, cinética yorganización de los complejos de adhesión focal. El análisis de la dinámica y difusiónde los complejos de adhesión focal y sus interacciones, fueron realizados mediante laespectroscopía por correlación de fluorescencia (FCS). Se caracterizaron loscoeficientes efectivos de difusión de las proteínas mencionadas. El análisis de lacorrelación cruzada de las fluctuaciones de fluorescencia de pares de proteínas deadhesión focal (FCCS) permitió evidenciar la interacción entre distintas proteínasadhesivas de la adhesión focal. La cinética de disociación de proteínas desde laadhesión focal fue evaluada mediante la recuperación de la fluorescencia luego delfotoblanqueo (FRAP) en diferentes condiciones. Para estudiar los cambios generados en la organización y dinámica de adhesionesfocales en células vivas en respuesta a un estímulo mecánico externo global, seempleó un dispositivo de tracción equibiaxial adaptado para ser usado en simultáneocon el microscopio confocal FV1000. La tensión mecánica aplicada por el dispositivode tracción es capaz de inducir cambios en el área de las células vivas al igual que enlas adhesiones focales. En respuesta al estiramiento mecánico se observó un mayorreclutamiento y translocación de la proteína zixina acompañado de una disminuciónsignificativa de su constante de disociación. Con el fin de correlacionar las propiedades mecánicas del sustrato y la fuerza detracción generada por la célula a nivel de las adhesiones focales, sin perder de vista laorganización y dinámica de las proteínas en la adhesión focal, se implementó la Microscopía de Fuerzas de Tracción (TFM). Esta técnica posee la sensibilidadnecesaria para medir la fuerza de tracción generada por la célula sobre un sustratoelástico y transparente, la cual se puede combinar con otras técnicas de microscopíade fluorescencia como FRAP o FCS. El análisis de los datos TFM para la proteínazixina permitió obtener los mapas de deformación y de fuerzas de tracción, a la vezque se evaluó la cinética de disociación mediante FRAP.
| Main Author: | |
|---|---|
| Other Authors: | |
| Format: | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis biblioteca |
| Language: | spa |
| Published: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
|
| Subjects: | MICROSCOPIA DE FUERZA ATOMICA, ESPECTROSCOPIA DE FUERZA, MECANOTRANSDUCCION, CELULAS VIVAS, MICROSCOPIA DE FUERZAS DE TRACCION, ATOMIC FORCE MICROSCOPY, FORCE SPECTROSCOPY, MECHANOTRANSDUCTION, LIVING CELLS, TRACTION FORCE MICROSCOPY, |
| Online Access: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5945_Bianchi http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n5945_Bianchi_oai |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Summary: | Las células pueden detectar, generar y responder a un amplio rango de señalesexternas, químicas y físicas, integrar y analizar esta información y, en consecuencia,cambiar su morfología, dinámica, comportamiento y, eventualmente, destino. A nivelcelular, las respuestas biológicas a fuerzas externas se originan en dos tipos deestructuras especializadas: adhesiones focales (célula-matriz extracelular) y unionesadherentes (célula-célula). Las adhesiones focales son complejos de proteínasdispuestos en ensamblados multi-moleculares que unen la matriz extracelular, a travésde receptores integrales de membrana, a componentes del citoesqueleto. Estos sitiosde adhesión son estructuras planas, alargadas de unos pocos micrones cuadradosque a menudo están localizadas en la periferia de las células, y que ademásfuncionarían como organelas de señalización en el proceso de mecanotransduccióncelular. Uno de los retos que se presenta para estudiar el sistema es el de poderintegrar y combinar distintas técnicas que nos permitan analizar la dinámicaintracelular, la biomecánica de la célula/sustrato, detección de las fuerzas generadasen/por la célula, y observar la respuesta global de la célula en las distintascondiciones. Entonces, el estudio de la estructura, mecánica y dinámica de lasproteínas de adhesiones focales en respuesta a un estímulo mecánico en células vivasrequiere de técnicas que permitan visualizar y caracterizar en forma integrada ladinámica de eventos localizados en la célula. Estos métodos deben contar con unaresolución espacio-temporal alta, de forma tal que permitan detectar eventostransientes y altamente localizados. En este contexto, se han implementado, en estetrabajo de Tesis, distintas microscopías y espectroscopías de alta resolución espacialy temporal, en combinación con técnicas de biología molecular y celular. Con el objetivo de caracterizar las propiedades mecánicas de sustratos y células, enuna primera etapa se implementó un modo de operación avanzado en microscopía defuerza atómica (AFM), denominado PF-QNM (del inglés, Peak Force Quantitative Nanomechanical Property Mapping). Este modo permite obtener simultáneamente laimagen de topografía, junto con los mapas cuantitativos sobre las propiedades deelasticidad, adhesión, dureza, disipación de energía y deformación superficial. Seutilizaron sistemas modelo con distintas propiedades mecánicas de manera tal decubrir el amplio rango que va desde GPa a kPa, y estudiar las propiedades desustratos (vidrio, membranas de silicona y geles de poliacrilamina), así también comola línea celular utilizada en la Tesis. A nivel de adhesión focal, la estrategia fue transfectar células de epitelio mamario deratón (HC11), con proteínas componentes de la adhesión (por ejemplo, zixina, FAK,vinculina, paxilina) fusionadas a proteínas fluorescentes visibles. De esta forma,empleando microscopías y espectroscopías de fluorescencia, es posible visualizar laexpresión de las proteínas, registrar su localización y evolución en el tiempo y,mediante diferentes análisis, extraer información cuantitativa de dinámica, cinética yorganización de los complejos de adhesión focal. El análisis de la dinámica y difusiónde los complejos de adhesión focal y sus interacciones, fueron realizados mediante laespectroscopía por correlación de fluorescencia (FCS). Se caracterizaron loscoeficientes efectivos de difusión de las proteínas mencionadas. El análisis de lacorrelación cruzada de las fluctuaciones de fluorescencia de pares de proteínas deadhesión focal (FCCS) permitió evidenciar la interacción entre distintas proteínasadhesivas de la adhesión focal. La cinética de disociación de proteínas desde laadhesión focal fue evaluada mediante la recuperación de la fluorescencia luego delfotoblanqueo (FRAP) en diferentes condiciones. Para estudiar los cambios generados en la organización y dinámica de adhesionesfocales en células vivas en respuesta a un estímulo mecánico externo global, seempleó un dispositivo de tracción equibiaxial adaptado para ser usado en simultáneocon el microscopio confocal FV1000. La tensión mecánica aplicada por el dispositivode tracción es capaz de inducir cambios en el área de las células vivas al igual que enlas adhesiones focales. En respuesta al estiramiento mecánico se observó un mayorreclutamiento y translocación de la proteína zixina acompañado de una disminuciónsignificativa de su constante de disociación. Con el fin de correlacionar las propiedades mecánicas del sustrato y la fuerza detracción generada por la célula a nivel de las adhesiones focales, sin perder de vista laorganización y dinámica de las proteínas en la adhesión focal, se implementó la Microscopía de Fuerzas de Tracción (TFM). Esta técnica posee la sensibilidadnecesaria para medir la fuerza de tracción generada por la célula sobre un sustratoelástico y transparente, la cual se puede combinar con otras técnicas de microscopíade fluorescencia como FRAP o FCS. El análisis de los datos TFM para la proteínazixina permitió obtener los mapas de deformación y de fuerzas de tracción, a la vezque se evaluó la cinética de disociación mediante FRAP. |
|---|