Modulación de los receptores GABA Ap1 por especies reactivas del oxígeno y benzodiazepinas
Las especies reactivas del oxígeno (ROS) se asocian generalmente con estrés oxidativo celular,pero también tienen un importante rol como mensajeros celulares en la señalización redox, porejemplo, modulando la actividad de los receptores de neurotransmisores y canales iónicos. Hasta elmomento no se habían demostrado acciones directas de las ROS sobre los receptores GABAA. En estetrabajo se estudiaron los efectos de las ROS sobre la función del receptor GABAAρ1. Se expresaronreceptores homoméricos GABAAρ1 humanos en oocitos de Xenopus laevis y se registraronelectrofisiológicamente las respuestas evocadas por GABA en presencia o ausencia de ROS. Lasrespuestas GABAAρ1 se potenciaron significativamente en presencia de H2O2, en forma reversible ydosis dependiente. Los efectos potenciadores se atenuaron en presencia de un scavenger deradicales libres, ácido lipoico, y un inhibidor de la reacción de Fenton, deferoxamina. Para identificarlos residuos involucrados en las acciones de las ROS se realizaron ensayos de protección química decisteínas con agentes selectivos de sulfhidrilos y mutagénesis sitio dirigida. Cada subunidad ρ1contiene solo tres residuos de cisteína, dos extracelulares en el Cys-loop (C177 y C191) y unaintracelular (C364) en el bucle TM3-TM4. La sustitución de la C364 por alanina o serina generóreceptores mutantes completamente insensibles a la potenciación por ROS. Las cisteínas del Cys-loopno resultaron esenciales para la modulación por ROS. Nuestros resultados muestran que las ROSpotencian la función de los receptores de GABAAρ1 y que la cisteína intracelular C364 es el sensorpara las acciones de ROS. Por otro lado, varios subtipos de receptores GABAA son modulados alostéricamente porbenzodiazepinas (BZD), drogas ampliamente usadas como ansiolíticos, hipnóticos sedantes yanticonvulsivos. Se identificó un sitio de unión a BDZs de alta afinidad y al menos tres sitiosadicionales de baja afinidad en variantes heteroméricos y homomericos de receptores GABAA. Sinembargo, nunca se había reportado la modulación de receptores GABAAρ1 por BDZs y durantemucho tiempo se los asumió como completamente insensibles. En el presente estudio, se expresaronheterólogamente receptores GABAAρ1 en oocitos y se registraron las respuestas evocadas por GABAen presencia y ausencia de BDZs. El diazepam y 4'-Cl diazepam modularon las respuestas GABAAρ1 enel rango micromolar de forma reversible, dependiente de la concentración e independiente delvoltaje. El diazepam potenció las corrientes de Cl- evocadas por GABA y el 4'- Cl diazepam produjoefectos bifásicos dependiendo de la concentración de GABA, mientras que Ro15-4513 y alprazolamactuaron como moduladores negativos. Las acciones de las BDZs resultaron insensibles a flumazenil. Otras BZDs no mostraron actividad significativa en condiciones experimentales equivalentes. Nuestros resultados sugieren que las BZDs pueden modular la función del receptor GABAAρ1 deforma selectiva y diferencial.
| Main Author: | |
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| Other Authors: | |
| Format: | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis biblioteca |
| Language: | spa |
| Published: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
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| Subjects: | RECEPTOR GABA A, RECEPTOR GABA AP1, ESPECIES REACTIVAS DEL OXIGENO, BENZODIAZEPINAS, RETINA, GABA A, RECEPTOR, GABA AP1 RECEPTOR, REACTIVE OXYGEN SPECIES, BENZODIAZEPINES, |
| Online Access: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5761_BeltranGonzalez https://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n5761_BeltranGonzalez_oai |
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| Summary: | Las especies reactivas del oxígeno (ROS) se asocian generalmente con estrés oxidativo celular,pero también tienen un importante rol como mensajeros celulares en la señalización redox, porejemplo, modulando la actividad de los receptores de neurotransmisores y canales iónicos. Hasta elmomento no se habían demostrado acciones directas de las ROS sobre los receptores GABAA. En estetrabajo se estudiaron los efectos de las ROS sobre la función del receptor GABAAρ1. Se expresaronreceptores homoméricos GABAAρ1 humanos en oocitos de Xenopus laevis y se registraronelectrofisiológicamente las respuestas evocadas por GABA en presencia o ausencia de ROS. Lasrespuestas GABAAρ1 se potenciaron significativamente en presencia de H2O2, en forma reversible ydosis dependiente. Los efectos potenciadores se atenuaron en presencia de un scavenger deradicales libres, ácido lipoico, y un inhibidor de la reacción de Fenton, deferoxamina. Para identificarlos residuos involucrados en las acciones de las ROS se realizaron ensayos de protección química decisteínas con agentes selectivos de sulfhidrilos y mutagénesis sitio dirigida. Cada subunidad ρ1contiene solo tres residuos de cisteína, dos extracelulares en el Cys-loop (C177 y C191) y unaintracelular (C364) en el bucle TM3-TM4. La sustitución de la C364 por alanina o serina generóreceptores mutantes completamente insensibles a la potenciación por ROS. Las cisteínas del Cys-loopno resultaron esenciales para la modulación por ROS. Nuestros resultados muestran que las ROSpotencian la función de los receptores de GABAAρ1 y que la cisteína intracelular C364 es el sensorpara las acciones de ROS. Por otro lado, varios subtipos de receptores GABAA son modulados alostéricamente porbenzodiazepinas (BZD), drogas ampliamente usadas como ansiolíticos, hipnóticos sedantes yanticonvulsivos. Se identificó un sitio de unión a BDZs de alta afinidad y al menos tres sitiosadicionales de baja afinidad en variantes heteroméricos y homomericos de receptores GABAA. Sinembargo, nunca se había reportado la modulación de receptores GABAAρ1 por BDZs y durantemucho tiempo se los asumió como completamente insensibles. En el presente estudio, se expresaronheterólogamente receptores GABAAρ1 en oocitos y se registraron las respuestas evocadas por GABAen presencia y ausencia de BDZs. El diazepam y 4'-Cl diazepam modularon las respuestas GABAAρ1 enel rango micromolar de forma reversible, dependiente de la concentración e independiente delvoltaje. El diazepam potenció las corrientes de Cl- evocadas por GABA y el 4'- Cl diazepam produjoefectos bifásicos dependiendo de la concentración de GABA, mientras que Ro15-4513 y alprazolamactuaron como moduladores negativos. Las acciones de las BDZs resultaron insensibles a flumazenil. Otras BZDs no mostraron actividad significativa en condiciones experimentales equivalentes. Nuestros resultados sugieren que las BZDs pueden modular la función del receptor GABAAρ1 deforma selectiva y diferencial. |
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