Efectos de la interacción entre compuestos tóxicos en Trucha Arcoíris (Oncorhynchus mykiss)
En esta tesis se estudiaron los mecanismos de regulación molecular (a través de receptores nucleares) implicados en la biotransformación y excre- ción del clorpirifos (CLF) e hidrocarburos de petróleo; los efectos de la in- teracción entre ambos compuestos tóxicos sobre enzimas detoxificantes y la influencia de CLF sobre los transportadores ABCCs en trucha arcoı́ris (Oncorhynchus mykiss). Se ha descripto que algunos hidrocarburos aromáticos policı́clicos (HAP) inducen la expresión de la enzima citocromo P450 mono- oxigenasa 1A (CYP1A) a través de la activación del receptor de aril hidrocar- buros (AhR). A su vez, la enzima CYP1A cataliza la conversión del pesticida CLF a su derivado más activo, CLF-oxón. De acuerdo a esto, la hipótesis I de esta tesis postula que hidrocarburos aromáticos, presentes en la fracción soluble de petróleo (WAF), activan la vı́a del receptor AhR en el hı́gado de la trucha arcoı́ris, induciendo la expresión y la actividad de la enzima CYP1A con el consiguiente aumento de la toxicidad de CLF. Para ponerla a prueba se expusieron juveniles de O. mykiss en acuarios individuales con y sin WAF in vivo por 48 h (pretratamiento y control) y luego se expusieron finas secciones de hı́gado de individuos de ambos grupos a CLF o control de solvente (acetona, SC). Los peces expuestos a WAF mostraron inducción en la expresión génica de AhR ası́ como de CYP1A. Coherentemente la expre- sión proteica de CYP1A también se vió inducida, sin embargo no se observó aumento de actividad enzimática de CYP1A (medida como la actividad de 7-etoxi-resorufina-O-desetilasa (EROD)). Por otro lado, la expresión génica del translocador nuclear de AhR (ARNT) fue menor en los peces expuestos a WAF. Además, la exposición a CLF en los hı́gados inhibió las actividades enzimáticas EROD, acetilcolinesterasa (AChE) y carboxilesterasas (CEs) y aumentó la actividad de la enzima detoxificante GST, independientemente del pretratamiento con WAF. El pretratamiento de WAF no afectó las acti- vidades de EROD, AChE y GST. Solo la actividad de CEs se vio afectada por WAF, con un efecto inhibitorio y aditivo al efecto de CLF. En el mismo experimento, se analizó la expresión de genes relacionados con defensa an- tioxidante y detoxificante, sistema inmune, estrés y de receptores nucleares relacionados con hormonas sexuales y de regulación metabólica, a fin de ex- plorar una posible interacción de la vı́a AhR con otras vı́as regulatorias. En este sentido, la exposición a WAF indujo la expresión génica de los receptores de progesterona, de andrógenos y del receptor X de hı́gado (LXR) pero no afectó a los receptores de estrógenos y mineralocorticoides. Además, la ex- posición a WAF indujo la expresión de varias interleucinas y afectó la vı́a de las caspasas. Se realizó también un estudio histopatológico del hı́gado el cuál mostró evidencias de esteatosis (acumulación de grasa), que podrı́a asociarse a la inducción de LXR, ya que una de sus funciones es estimular la lipogéne- sis en hı́gado. La hipótesis II postula que CLF activa la vı́a del receptor de pregnano (PXR) en peces, aumentando la expresión de la baterı́a de genes corriente abajo del elemento regulatorio. Se estudió el efecto de CLF como inductor de PXR y genes que, según la literatura, son activados por la vı́a de este receptor (PXR, CYP3A27, GST, ABCB1/Pgp, UGT ABCC2/MRP2 ) en intestino e hı́gado de juveniles de O.mykiss expuestos in vivo a CLF por 12, 24 y 48 h. En el mismo experimento, se estudió la respuesta de la ex- presión genica de otras enzimas de Fase I (CYP2M1, CYP2K1 y FMO) y se analizó la expresión de genes de la vı́a AhR a fin de explorar una posi- ble interacción de ambas vı́as regulatorias. El efecto a CLF sobre la vı́a de PXR resultó dependiente del órgano estudiado y del tiempo de exposición. En principio, la expresión de PXR se incrementó solo para el intestino, a las 12 h de exposición, acompañado por una disminución de la expresión de AhR y CYP1A y una inducción del ARNT. En intestino también a las 12 h, se observó disminución de la expresión de AhR y de CYP1A e inducción de ARNT. Por otro lado, en el hı́gado la exposición a CLF, a las 12 h, mostró una disminución en la expresión de los trasportadores ABCB1 y ABCC2 pero no se observó modulada la expresión de ninguno de los receptores (PXR-AhR). Además a las 24 horas de exposición la expresión de ABCC2 continuó dismi- nuida y también disminuyó la expresión de AhR. Mientras que la expresión de UGT (gen regulado por PXR) se observó aumentada, tambień a las 24 horas de exposición. Por último la hipótesis III postula que CLF afecta la función de proteı́nas de transporte responsables de la resistencia a múltiples xenobióticos (MXR), las ABCCs (proteı́nas asociadas a la resistencia multi- drogas), produciendo inhibición competitiva, sensibilización o activación del transporte de dichas proteı́nas. Para poner a prueba dicha hipótesis, se reali- zaron preparaciones ex vivo de intestino y se las expuso a tres concentraciones de CLF. En estas preparaciones se midió la tasa de transporte del sustrato 2,4-dinitrofenil-S-glutatión (DNP-SG, que refleja el de transporte de solu- tos orgánicos hacia afuera de la célula a través de proteı́nas de membrana de la familia ABCC). Si el CLF fuera sustrato de transporte por ABCC, la tasa de transporte de DNP-SG deberı́a disminuir por competencia. Los re- sultados de este experimento no muestran inhibición del flujo de DNP-SG, por consiguiente, se considera que las proteı́nas ABCC no participan en el transporte celular de CLF en el intestino de O. mykiss. Por el contrario, se observó estimulación en el transporte de DNP-SG en el corto término y será interesante para trabajos futuros investigar los mecanismos involucrados en dicho efecto. Esta tesis permitió concluı́r que los hidrocarburos presentes en la WAF modulan la vı́a del receptor AhR, activando la expresión de dicho receptor y la de su gen blanco CYP1A en O. mykiss, sin embargo no hay incidencia clara de dicha inducción sobre la actividad de CYP1A ni sobre la toxicidad de CLF. Por otro lado, CLF induce débilmente la vı́a del receptor nuclear PXR y disminuye la expresión de genes de la vı́a de AhR en intestino y en hı́gado. Ademas, la expresión génica de ARNT disminuye cuando se encuentra activada la vı́a de AhR, tanto en hı́gado como en intestino, mos- trando una posible forma de regulación de esta vı́a que no ha sido descripta hasta ahora. Por último, se puedo concluı́r que CLF estimula la actividad de proteı́nas transportadoras de la familia ABCC en intestino.
| Main Author: | |
|---|---|
| Other Authors: | |
| Format: | TesisdePostgrado biblioteca |
| Language: | spa |
| Published: |
Universidad Nacional del Comahue. Centro Regional Universitario Bariloche
2021-03-10T15:13:50Z
|
| Subjects: | Trucha arcoíris, Hidrocarburos, Pesticidas, Receptores nucleares, Ciencias Puras, |
| Online Access: | http://rdi.uncoma.edu.ar/handle/uncomaid/16125 |
| Tags: |
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| Summary: | En esta tesis se estudiaron los mecanismos de regulación molecular (a
través de receptores nucleares) implicados en la biotransformación y excre-
ción del clorpirifos (CLF) e hidrocarburos de petróleo; los efectos de la in-
teracción entre ambos compuestos tóxicos sobre enzimas detoxificantes y la
influencia de CLF sobre los transportadores ABCCs en trucha arcoı́ris (Oncorhynchus mykiss). Se ha descripto que algunos hidrocarburos aromáticos
policı́clicos (HAP) inducen la expresión de la enzima citocromo P450 mono-
oxigenasa 1A (CYP1A) a través de la activación del receptor de aril hidrocar-
buros (AhR). A su vez, la enzima CYP1A cataliza la conversión del pesticida
CLF a su derivado más activo, CLF-oxón. De acuerdo a esto, la hipótesis I
de esta tesis postula que hidrocarburos aromáticos, presentes en la fracción
soluble de petróleo (WAF), activan la vı́a del receptor AhR en el hı́gado
de la trucha arcoı́ris, induciendo la expresión y la actividad de la enzima
CYP1A con el consiguiente aumento de la toxicidad de CLF. Para ponerla a
prueba se expusieron juveniles de O. mykiss en acuarios individuales con y
sin WAF in vivo por 48 h (pretratamiento y control) y luego se expusieron
finas secciones de hı́gado de individuos de ambos grupos a CLF o control de
solvente (acetona, SC). Los peces expuestos a WAF mostraron inducción en
la expresión génica de AhR ası́ como de CYP1A. Coherentemente la expre-
sión proteica de CYP1A también se vió inducida, sin embargo no se observó
aumento de actividad enzimática de CYP1A (medida como la actividad de
7-etoxi-resorufina-O-desetilasa (EROD)). Por otro lado, la expresión génica
del translocador nuclear de AhR (ARNT) fue menor en los peces expuestos
a WAF. Además, la exposición a CLF en los hı́gados inhibió las actividades enzimáticas EROD, acetilcolinesterasa (AChE) y carboxilesterasas (CEs) y
aumentó la actividad de la enzima detoxificante GST, independientemente
del pretratamiento con WAF. El pretratamiento de WAF no afectó las acti-
vidades de EROD, AChE y GST. Solo la actividad de CEs se vio afectada
por WAF, con un efecto inhibitorio y aditivo al efecto de CLF. En el mismo
experimento, se analizó la expresión de genes relacionados con defensa an-
tioxidante y detoxificante, sistema inmune, estrés y de receptores nucleares
relacionados con hormonas sexuales y de regulación metabólica, a fin de ex-
plorar una posible interacción de la vı́a AhR con otras vı́as regulatorias. En
este sentido, la exposición a WAF indujo la expresión génica de los receptores
de progesterona, de andrógenos y del receptor X de hı́gado (LXR) pero no
afectó a los receptores de estrógenos y mineralocorticoides. Además, la ex-
posición a WAF indujo la expresión de varias interleucinas y afectó la vı́a de
las caspasas. Se realizó también un estudio histopatológico del hı́gado el cuál
mostró evidencias de esteatosis (acumulación de grasa), que podrı́a asociarse
a la inducción de LXR, ya que una de sus funciones es estimular la lipogéne-
sis en hı́gado. La hipótesis II postula que CLF activa la vı́a del receptor de
pregnano (PXR) en peces, aumentando la expresión de la baterı́a de genes
corriente abajo del elemento regulatorio. Se estudió el efecto de CLF como
inductor de PXR y genes que, según la literatura, son activados por la vı́a de
este receptor (PXR, CYP3A27, GST, ABCB1/Pgp, UGT ABCC2/MRP2 )
en intestino e hı́gado de juveniles de O.mykiss expuestos in vivo a CLF por
12, 24 y 48 h. En el mismo experimento, se estudió la respuesta de la ex-
presión genica de otras enzimas de Fase I (CYP2M1, CYP2K1 y FMO) y
se analizó la expresión de genes de la vı́a AhR a fin de explorar una posi-
ble interacción de ambas vı́as regulatorias. El efecto a CLF sobre la vı́a de
PXR resultó dependiente del órgano estudiado y del tiempo de exposición.
En principio, la expresión de PXR se incrementó solo para el intestino, a
las 12 h de exposición, acompañado por una disminución de la expresión de
AhR y CYP1A y una inducción del ARNT. En intestino también a las 12 h,
se observó disminución de la expresión de AhR y de CYP1A e inducción de
ARNT. Por otro lado, en el hı́gado la exposición a CLF, a las 12 h, mostró una
disminución en la expresión de los trasportadores ABCB1 y ABCC2 pero no
se observó modulada la expresión de ninguno de los receptores (PXR-AhR).
Además a las 24 horas de exposición la expresión de ABCC2 continuó dismi-
nuida y también disminuyó la expresión de AhR. Mientras que la expresión
de UGT (gen regulado por PXR) se observó aumentada, tambień a las 24
horas de exposición. Por último la hipótesis III postula que CLF afecta la
función de proteı́nas de transporte responsables de la resistencia a múltiples
xenobióticos (MXR), las ABCCs (proteı́nas asociadas a la resistencia multi-
drogas), produciendo inhibición competitiva, sensibilización o activación del
transporte de dichas proteı́nas. Para poner a prueba dicha hipótesis, se reali-
zaron preparaciones ex vivo de intestino y se las expuso a tres concentraciones
de CLF. En estas preparaciones se midió la tasa de transporte del sustrato
2,4-dinitrofenil-S-glutatión (DNP-SG, que refleja el de transporte de solu-
tos orgánicos hacia afuera de la célula a través de proteı́nas de membrana
de la familia ABCC). Si el CLF fuera sustrato de transporte por ABCC, la
tasa de transporte de DNP-SG deberı́a disminuir por competencia. Los re-
sultados de este experimento no muestran inhibición del flujo de DNP-SG,
por consiguiente, se considera que las proteı́nas ABCC no participan en el
transporte celular de CLF en el intestino de O. mykiss. Por el contrario, se
observó estimulación en el transporte de DNP-SG en el corto término y será
interesante para trabajos futuros investigar los mecanismos involucrados en
dicho efecto. Esta tesis permitió concluı́r que los hidrocarburos presentes en
la WAF modulan la vı́a del receptor AhR, activando la expresión de dicho
receptor y la de su gen blanco CYP1A en O. mykiss, sin embargo no hay
incidencia clara de dicha inducción sobre la actividad de CYP1A ni sobre la
toxicidad de CLF. Por otro lado, CLF induce débilmente la vı́a del receptor
nuclear PXR y disminuye la expresión de genes de la vı́a de AhR en intestino
y en hı́gado. Ademas, la expresión génica de ARNT disminuye cuando se
encuentra activada la vı́a de AhR, tanto en hı́gado como en intestino, mos-
trando una posible forma de regulación de esta vı́a que no ha sido descripta
hasta ahora. Por último, se puedo concluı́r que CLF estimula la actividad de
proteı́nas transportadoras de la familia ABCC en intestino. |
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