Mise au point d'outils moléculaires pour l'identification des flores fongiques ochratoxinogènes : application à la traçabilité du café Camerounais
Les graves risques que l'ochratoxine A (OTA) engendre sur la santé des consommateurs, ont conduit les instances sanitaires de l'Union Européenne à établir des normes qui définissent les limites maximales tolérables dans plusieurs denrées agricoles et dans le café en particulier. Avec le nouveau règlement européen 178/2002 imposant la détermination d'origine géographique dans le processus de traçabilité des produits alimentaires au cours des transactions commerciales, les normes se durcissent. Dans la pratique, il est difficile de déterminer avec exactitude l'origine géographique des produits alimentaires. Le présent travail a eu pour objectif de déterminer les teneurs en OTA du café par dosage chromatographique, d'identifier et de mettre en oeuvre une méthode utilisant la PCR-DGGE pour analyser la totalité des flores fongiques présentes sur les échantillons de café et de déterminer l'origine géographique de ce dernier. 104 échantillons de café ont été collectés dans la région de l'Ouest (Bafoussam, Dschang, Bafang et Santchou) et dans la plaine côtière (Melong) du Cameroun durant deux campagnes caféières: 2009 et 2010. Deux traitements ont été évalués (voie sèche et voie humide) à trois étapes différentes du procédé de transformation (café en parche, en coque et café vert). La caractérisation du profil fongique des échantillons de café, s'est faite par les techniques microbiologiques classiques et par PCR-séquençage, les niveaux d'OTA ont été évalués par HPLC après extraction et filtration dans une colonne d'immunoaffinité. Les résultats obtenus ont indiqué un pourcentage de contamination fongique totale compris entre 60-92% en 2009 et 70-90% en 2010; la mycoflore toxinogène associée aux grains de café contaminés par l'OTA est constituée majoritairement d'A. carbonarius et d'A. niger. Le stade de prélèvement a eu une influence significative sur la teneur en OTA du café, et le site n'a eu aucune influence sur celle-ci. Exception faite des échantillons de cafés issus du traitement par voie humide du début de la campagne caféière 2009 (124,1 ?g/Kg et 46,81 ?g/Kg), les analyses réalisées sur les échantillons de café montrent que de façon globale, les grains de café provenant des deux campagnes caféières ont des faibles teneurs en OTA (0,1 - 5,11 ?g/Kg). Dans la présente étude, la technique moléculaire employant l'ADNr 28S en PCR-DGGE a été utilisée afin de détecter la variation des structures de la communauté fongique du café des cinq localités soumises à cette étude. Cette technique a permis de mettre en évidence un plus grand nombre d'espèces fongiques comparé à la méthode culturale classique. De plus, la PCR-DGGE a révélé que chaque site a un profil fongique qui lui est caractéristique, et malgré le fait que le type de traitement influence sur la population fongique, il y a eu des bandes communes aux échantillons de café provenant de tous les sites, ceux-ci peuvent constituer des marqueurs biologiques potentiels pour assurer la traçabilité du café de ces régions. La PCR-DGGE ayant l'avantage d'être plus rapide (24h) que l'ensemble des techniques utilisées en microbiologie classique, permet d'éviter l'analyse précise des champignons par biochimie ou en biologie moléculaire (séquençage). Elle peut donc être proposée comme un outil de traçabilité analytique rapide pour le café camerounais.
| Summary: | Les graves risques que l'ochratoxine A (OTA) engendre sur la santé des consommateurs, ont conduit les instances sanitaires de l'Union Européenne à établir des normes qui définissent les limites maximales tolérables dans plusieurs denrées agricoles et dans le café en particulier. Avec le nouveau règlement européen 178/2002 imposant la détermination d'origine géographique dans le processus de traçabilité des produits alimentaires au cours des transactions commerciales, les normes se durcissent. Dans la pratique, il est difficile de déterminer avec exactitude l'origine géographique des produits alimentaires. Le présent travail a eu pour objectif de déterminer les teneurs en OTA du café par dosage chromatographique, d'identifier et de mettre en oeuvre une méthode utilisant la PCR-DGGE pour analyser la totalité des flores fongiques présentes sur les échantillons de café et de déterminer l'origine géographique de ce dernier. 104 échantillons de café ont été collectés dans la région de l'Ouest (Bafoussam, Dschang, Bafang et Santchou) et dans la plaine côtière (Melong) du Cameroun durant deux campagnes caféières: 2009 et 2010. Deux traitements ont été évalués (voie sèche et voie humide) à trois étapes différentes du procédé de transformation (café en parche, en coque et café vert). La caractérisation du profil fongique des échantillons de café, s'est faite par les techniques microbiologiques classiques et par PCR-séquençage, les niveaux d'OTA ont été évalués par HPLC après extraction et filtration dans une colonne d'immunoaffinité. Les résultats obtenus ont indiqué un pourcentage de contamination fongique totale compris entre 60-92% en 2009 et 70-90% en 2010; la mycoflore toxinogène associée aux grains de café contaminés par l'OTA est constituée majoritairement d'A. carbonarius et d'A. niger. Le stade de prélèvement a eu une influence significative sur la teneur en OTA du café, et le site n'a eu aucune influence sur celle-ci. Exception faite des échantillons de cafés issus du traitement par voie humide du début de la campagne caféière 2009 (124,1 ?g/Kg et 46,81 ?g/Kg), les analyses réalisées sur les échantillons de café montrent que de façon globale, les grains de café provenant des deux campagnes caféières ont des faibles teneurs en OTA (0,1 - 5,11 ?g/Kg). Dans la présente étude, la technique moléculaire employant l'ADNr 28S en PCR-DGGE a été utilisée afin de détecter la variation des structures de la communauté fongique du café des cinq localités soumises à cette étude. Cette technique a permis de mettre en évidence un plus grand nombre d'espèces fongiques comparé à la méthode culturale classique. De plus, la PCR-DGGE a révélé que chaque site a un profil fongique qui lui est caractéristique, et malgré le fait que le type de traitement influence sur la population fongique, il y a eu des bandes communes aux échantillons de café provenant de tous les sites, ceux-ci peuvent constituer des marqueurs biologiques potentiels pour assurer la traçabilité du café de ces régions. La PCR-DGGE ayant l'avantage d'être plus rapide (24h) que l'ensemble des techniques utilisées en microbiologie classique, permet d'éviter l'analyse précise des champignons par biochimie ou en biologie moléculaire (séquençage). Elle peut donc être proposée comme un outil de traçabilité analytique rapide pour le café camerounais. |
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