Purificação de antígenos do lentivirus caprino por coluna de afinidade.
No processo de purificação das proteínas dos lentivírus para produção de antígenos (Ags) ocorrem perdas principalmente das glicoproteinas por serem relativamente instáveis. Optou-se pela utilização de cromatografia em coluna de afinidade na purificação de proteínas do lentivírus caprino (LVC). No preparo da coluna de afinidade utilizou-se soro de caprinos positivo ao teste de microimunodifusão em gel de ágar (MIDGA) e pool de lotes de soro reagente integrante do kit comercial. A IgG foi obtida por precipitação em sulfato de amônio. A coluna foi preparada com proteina A imobilizada em sefarose CL-4B. Foi purificado o antígeno lote 1 (AgL1) obtido por concentração do sobrenadante de subcultivos de células de membrana sinovial caprina infectadas com LVC. O antigeno comercial (Agkit), AgL1 e o antígeno purificado (AgL1CA) foram submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), immunoblotting e ELISA indireto. Na eletroforese verificou-se no AgL1CA quatro proteínas de peso molecular (PM) aproximado: 8OkDa, 70kDa, 55kDa e 27kDa. No immunoblotting verificou-se que todos os Ags apresentaram uma banda de aproxitnadanente 27 kDa, sendo que, no AgL1CA ela foi mais intensa. No AgL1CA e AgL1 constatou-se outra banda de PM aproximado de 48 kDa, entretanto sendo bem mais forte no AgL1CA. No AgL1 observou-se, tanbém, uma banda com 70 kDa. Verificou-se, também, a presença da glicoproteina com PM variando de 140 a 145 kDa em todos os antígenos. Nos AgL1 e AgL1CA observou-se, ainda, uma banda de PM de 19kDa. Comparando as bandas observadas por SDS-PAGE com as do immunoblotting, pode-se verificar que nos AgKit e AgL1 somente a proteína p28 apareceu nitidamente. No ELISA indireto utilizando o AgL1CA observou-se que a diluição do soro de 1:200 e 200ng de antígeno apresentou uma diferença, entre as densidades ópticas do pool de soros positivos e negativos, de aproximadamente O,5 que viabiliza o desenvolvimento deste teste. Diante dos resultados verificou-se que o uso da cromatografia de afinidade é uma alternativa viável na obtenção de antígenos altamente purificados.
| Main Authors: | , , , , |
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| Other Authors: | |
| Format: | Anais e Proceedings de eventos biblioteca |
| Language: | pt_BR por |
| Published: |
2004-10-14
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| Subjects: | Antígenos., Caprino., Lentivirus., |
| Online Access: | http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/handle/doc/528725 |
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| Summary: | No processo de purificação das proteínas dos lentivírus para produção de antígenos (Ags) ocorrem perdas principalmente das glicoproteinas por serem relativamente instáveis. Optou-se pela utilização de cromatografia em coluna de afinidade na purificação de proteínas do lentivírus caprino (LVC). No preparo da coluna de afinidade utilizou-se soro de caprinos positivo ao teste de microimunodifusão em gel de ágar (MIDGA) e pool de lotes de soro reagente integrante do kit comercial. A IgG foi obtida por precipitação em sulfato de amônio. A coluna foi preparada com proteina A imobilizada em sefarose CL-4B. Foi purificado o antígeno lote 1 (AgL1) obtido por concentração do sobrenadante de subcultivos de células de membrana sinovial caprina infectadas com LVC. O antigeno comercial (Agkit), AgL1 e o antígeno purificado (AgL1CA) foram submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), immunoblotting e ELISA indireto. Na eletroforese verificou-se no AgL1CA quatro proteínas de peso molecular (PM) aproximado: 8OkDa, 70kDa, 55kDa e 27kDa. No immunoblotting verificou-se que todos os Ags apresentaram uma banda de aproxitnadanente 27 kDa, sendo que, no AgL1CA ela foi mais intensa. No AgL1CA e AgL1 constatou-se outra banda de PM aproximado de 48 kDa, entretanto sendo bem mais forte no AgL1CA. No AgL1 observou-se, tanbém, uma banda com 70 kDa. Verificou-se, também, a presença da glicoproteina com PM variando de 140 a 145 kDa em todos os antígenos. Nos AgL1 e AgL1CA observou-se, ainda, uma banda de PM de 19kDa. Comparando as bandas observadas por SDS-PAGE com as do immunoblotting, pode-se verificar que nos AgKit e AgL1 somente a proteína p28 apareceu nitidamente. No ELISA indireto utilizando o AgL1CA observou-se que a diluição do soro de 1:200 e 200ng de antígeno apresentou uma diferença, entre as densidades ópticas do pool de soros positivos e negativos, de aproximadamente O,5 que viabiliza o desenvolvimento deste teste. Diante dos resultados verificou-se que o uso da cromatografia de afinidade é uma alternativa viável na obtenção de antígenos altamente purificados. |
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