Análise do genoma funcional de Arachis pintoi e desenvolvimento de novos marcadores moleculares.
O amendoim forrageiro (Arachis pintoi Krapov. e W.C. Greg.) tem apresentado resultados importantes na pecuária por seu alto valor nutritivo, o que tem contribuído no aumento da produção de leite, ganho de peso no gado de corte e redução no tempo de abate em até nove meses. Além disso, seu uso como cobertura verde em consórcios com culturas comerciais tem contribuído na redução da erosão, manutenção da umidade do solo, ciclagem de nutrientes, fixação biológica de nitrogênio e baixas emissões de óxido nitroso. O uso de sequenciamento nova geração (NGS) pode auxiliar no conhecimento da biologia da espécie e desenvolvimento de novas cultivares. O objetivo do presente trabalho foi analisar o genoma funcional de Arachis pintoi por meio de dados de RNA-Seq e desenvolver novos marcadores moleculares single nucleotide polymorphisms (SNP) e microssatélites (SSR). Foram realizadas modificações no protocolo de cloreto de lítio para isolamento de RNA total que ajudaram a eliminar problemas associados com a presença de altas concentrações de metabólitos secundários em folhas de amendoim forrageiro e sem sinais de degradação. O RNA de duas cultivares (Belomonte e Amarillo MG-100) foi extraído e utilizado para montagem das bibliotecas, as quais foram sequenciadas e tiveram seu genoma funcional montado com o programa Trinity e metodologia de novo. O sequenciamento gerou aproximadamente 223 milhões de pair-end reads de alta qualidade. Um total de 98.432 transcritos com comprimento médio de 1.102,2 bp foram obtidos. O valor de N50 e a taxa de alinhamento completo foram 1.924 bp e 95%, respectivamente. A função molecular (36,0%) e o processo biológico (35,8%) apresentaram a maioria dos termos da Ontologia Genética atribuídos, enquanto em componente celular (28,2%) foi atribuído o menor número. Uma busca por SNPs funcionais e marcadores SSR identificou 374.385 e 4.461, respectivamente. Cento e oitenta e seis marcadores SSR foram selecionados para validação, dos quais 63 (33,87%) foram polimórficos com média de 7,37 alelos por loco. Os marcadores apresentaram elevados valores médios para conteúdo de informação polimórfica (PIC = 0,70) e poder discriminatório (D = 0,80). O marcador Ap(CT)75 foi capaz de realizar o fingerpriting das cultivares Belomonte, Amarillo MG-100, Alqueire 1, e BRS Mandobi, identificando perfis únicos. Trinta e três SSRs foram avaliados quanto à transferibilidade para amendoim e outras seis espécies silvestres do gênero Arachis, o que resultou em amplificação cruzada variável (63,64 a 100%). O loco Ap(CT)68 permitiu a certificação entre 229 cruzamentos. O polimorfismo dos alelos foi detectado em gel de agarose, permitindo a redução de custos e tempo necessário para o processo de identificação do híbrido. O conjunto dos resultados apresentados neste trabalho permitirão a aplicação de técnicas moleculares modernas como associação genômica, expressão diferencial e seleção genômica, os quais contribuirão significativamente para o conhecimento da biologia de A. pintoi e avanço do programa de melhoramento de Arachis. Forage peanuts (Arachis pintoi Krapov. and W.C. Greg.) has shown important results in livestock due to the high nutritional value, which has contributed to the increase in milk production, weight gain in beef cattle, and reduction in slaughter time by up to nine months. In addition, its use as green cover in associations with commercial crops has contributing to the erosion reduction, maintenance of soil moisture, nutrient cycling, biological nitrogen fixation and low nitrous oxide emissions. The use of next generation sequencing (NGS) can assist in understanding the biology of the species and the development of new cultivars. The objective of the present work was to analyze the functional genome of Arachis pintoi using RNA-Seq data and to develop new single nucleotide polymorphisms (SNP) and microsatellite (SSR) molecular markers. Modifications in lithium chloride protocol were performed for total RNA isolation that helped eliminate the problems associated with the presence of high concentrations of secondary metabolites in forage peanut leaves, and lacked signs of degradation. The RNA of two cultivars (Belomonte and Amarillo MG-100) was extracted and used to assemble the libraries, which were sequenced and had their transcriptome assembled with Trinity program and de novo methodology. The sequencing output generated approximately 223 million high-quality pair-end reads. A total of 98,432 transcripts with an average length of 1,102.2 bp were obtained. The N50 value and complete alignment rate were 1,924 bp and 95 %, respectively. The molecular function (36.0%) and biological process (35.8%) presented the majority of the Gene Ontology terms assigned, whereas in the cellular component (28.2%) were assigned the smaller number. A search for functional SNPs and SSRs markers identified 374,385 and 4,461, respectively. One hundred eighty-six SSR markers were selected for validation, of which 63 (33.87%) were polymorphic with average of 7.37 alleles per locus. The markers presented high average for polymorphic information content (PIC = 0.70) and discriminatory power (D = 0.80). The Ap(CT)75 marker was able to identify unique profiles among Belomonte, Amarillo MG-100, Alqueire 1, and BRS Mandobi. Thirty-three SSRs were evaluated for the transferability to peanut and other six wild species from Arachis genus, which resulted in variable cross-species amplification (63.64 to 100%). The Ap(CT)68 locus allowed the certification among 229 crosses. The allele polymorphism was detected on agarose gel, allowing the reduction of costs and time required for the hybrid identification process. The set of results presented in this work will allow the application of modern molecular techniques such as genomic association, differential expression and genomic selection, which will significantly contribute to the knowledge of the biology of A. pintoi and the advancement of the peanut breeding program.
| Main Author: | |
|---|---|
| Other Authors: | |
| Format: | Teses biblioteca |
| Language: | Portugues pt_BR |
| Published: |
2020-12-03
|
| Subjects: | Amendoim forrageiro, Forage peanut, Cacahuetes forrajeros, Marcador microssatélite, Genetic analysis, RNA-Seq, Leguminosas forrajeras, Fitomejoramiento, Polimorfismo de nucleótido simple, Repeticiones de microsatélite, Análisis genético, Leguminosa Forrageira, Melhoramento Genético Vegetal, Marcador Genético, Genoma, Análise, Forage legumes, Plant breeding, Genetic markers, Single nucleotide polymorphism, Microsatellite repeats, Genome, |
| Online Access: | http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/handle/doc/1127550 |
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| Summary: | O amendoim forrageiro (Arachis pintoi Krapov. e W.C. Greg.) tem apresentado resultados importantes na pecuária por seu alto valor nutritivo, o que tem contribuído no aumento da produção de leite, ganho de peso no gado de corte e redução no tempo de abate em até nove meses. Além disso, seu uso como cobertura verde em consórcios com culturas comerciais tem contribuído na redução da erosão, manutenção da umidade do solo, ciclagem de nutrientes, fixação biológica de nitrogênio e baixas emissões de óxido nitroso. O uso de sequenciamento nova geração (NGS) pode auxiliar no conhecimento da biologia da espécie e desenvolvimento de novas cultivares. O objetivo do presente trabalho foi analisar o genoma funcional de Arachis pintoi por meio de dados de RNA-Seq e desenvolver novos marcadores moleculares single nucleotide polymorphisms (SNP) e microssatélites (SSR). Foram realizadas modificações no protocolo de cloreto de lítio para isolamento de RNA total que ajudaram a eliminar problemas associados com a presença de altas concentrações de metabólitos secundários em folhas de amendoim forrageiro e sem sinais de degradação. O RNA de duas cultivares (Belomonte e Amarillo MG-100) foi extraído e utilizado para montagem das bibliotecas, as quais foram sequenciadas e tiveram seu genoma funcional montado com o programa Trinity e metodologia de novo. O sequenciamento gerou aproximadamente 223 milhões de pair-end reads de alta qualidade. Um total de 98.432 transcritos com comprimento médio de 1.102,2 bp foram obtidos. O valor de N50 e a taxa de alinhamento completo foram 1.924 bp e 95%, respectivamente. A função molecular (36,0%) e o processo biológico (35,8%) apresentaram a maioria dos termos da Ontologia Genética atribuídos, enquanto em componente celular (28,2%) foi atribuído o menor número. Uma busca por SNPs funcionais e marcadores SSR identificou 374.385 e 4.461, respectivamente. Cento e oitenta e seis marcadores SSR foram selecionados para validação, dos quais 63 (33,87%) foram polimórficos com média de 7,37 alelos por loco. Os marcadores apresentaram elevados valores médios para conteúdo de informação polimórfica (PIC = 0,70) e poder discriminatório (D = 0,80). O marcador Ap(CT)75 foi capaz de realizar o fingerpriting das cultivares Belomonte, Amarillo MG-100, Alqueire 1, e BRS Mandobi, identificando perfis únicos. Trinta e três SSRs foram avaliados quanto à transferibilidade para amendoim e outras seis espécies silvestres do gênero Arachis, o que resultou em amplificação cruzada variável (63,64 a 100%). O loco Ap(CT)68 permitiu a certificação entre 229 cruzamentos. O polimorfismo dos alelos foi detectado em gel de agarose, permitindo a redução de custos e tempo necessário para o processo de identificação do híbrido. O conjunto dos resultados apresentados neste trabalho permitirão a aplicação de técnicas moleculares modernas como associação genômica, expressão diferencial e seleção genômica, os quais contribuirão significativamente para o conhecimento da biologia de A. pintoi e avanço do programa de melhoramento de Arachis. Forage peanuts (Arachis pintoi Krapov. and W.C. Greg.) has shown important results in livestock due to the high nutritional value, which has contributed to the increase in milk production, weight gain in beef cattle, and reduction in slaughter time by up to nine months. In addition, its use as green cover in associations with commercial crops has contributing to the erosion reduction, maintenance of soil moisture, nutrient cycling, biological nitrogen fixation and low nitrous oxide emissions. The use of next generation sequencing (NGS) can assist in understanding the biology of the species and the development of new cultivars. The objective of the present work was to analyze the functional genome of Arachis pintoi using RNA-Seq data and to develop new single nucleotide polymorphisms (SNP) and microsatellite (SSR) molecular markers. Modifications in lithium chloride protocol were performed for total RNA isolation that helped eliminate the problems associated with the presence of high concentrations of secondary metabolites in forage peanut leaves, and lacked signs of degradation. The RNA of two cultivars (Belomonte and Amarillo MG-100) was extracted and used to assemble the libraries, which were sequenced and had their transcriptome assembled with Trinity program and de novo methodology. The sequencing output generated approximately 223 million high-quality pair-end reads. A total of 98,432 transcripts with an average length of 1,102.2 bp were obtained. The N50 value and complete alignment rate were 1,924 bp and 95 %, respectively. The molecular function (36.0%) and biological process (35.8%) presented the majority of the Gene Ontology terms assigned, whereas in the cellular component (28.2%) were assigned the smaller number. A search for functional SNPs and SSRs markers identified 374,385 and 4,461, respectively. One hundred eighty-six SSR markers were selected for validation, of which 63 (33.87%) were polymorphic with average of 7.37 alleles per locus. The markers presented high average for polymorphic information content (PIC = 0.70) and discriminatory power (D = 0.80). The Ap(CT)75 marker was able to identify unique profiles among Belomonte, Amarillo MG-100, Alqueire 1, and BRS Mandobi. Thirty-three SSRs were evaluated for the transferability to peanut and other six wild species from Arachis genus, which resulted in variable cross-species amplification (63.64 to 100%). The Ap(CT)68 locus allowed the certification among 229 crosses. The allele polymorphism was detected on agarose gel, allowing the reduction of costs and time required for the hybrid identification process. The set of results presented in this work will allow the application of modern molecular techniques such as genomic association, differential expression and genomic selection, which will significantly contribute to the knowledge of the biology of A. pintoi and the advancement of the peanut breeding program. |
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