Estudio del impacto de la infección por el Mal de Río Cuarto virus (MRCV) en el metabolismo de gramíneas y análisis del rol de las proteínas virales con posible localización nuclear en la patogénesis

El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causa la enfermedad viral más importante del maíz en nuestro país. Los síntomas pueden ser muy severos e incluyen enanismo y reducción de la producción de granos. En las plantas la replicación viral está limitada al floema, mientras que en insectos ocurre en todos los tejidos y es asintomática. Si bien se ha avanzado en el estudio de esta enfermedad, aún se desconocen en profundidad las bases moleculares y fisiológicas que subyacen a los síntomas y se carece de especies modelo convenientes para el estudio de esta enfermedad. Un ensayo de RNAseq realizado por nuestro grupo en hojas de trigo a 12 y 21 días posinfección (dpi) reveló que la infección por MRCV genera un profundo impacto en el transcriptoma a 21 dpi, coincidente con la aparición de los síntomas. Por su parte, a 12 dpi las plantas no presentan síntomas y solamente se identificaron unos pocos genes diferencialmente expresados. Con el objetivo de profundizar en el estudio del impacto de la infección del MRCV en gramíneas, se cuantificaron numerosos compuestos derivados del metabolismo primario y se analizó el perfil hormonal en hojas de plantas de trigo infectadas provenientes del ensayo de RNAseq mencionado. Se determinó que las hojas de plantas infectadas presentan un mayor contenido de azúcares solubles, almidón, aminoácidos, proteínas y distintos metabolitos a 21 dpi mientras que no se detectaron cambios significativos a 12 dpi. De manera interesante, uno de los metabolitos aumentados ante la infección es la Tre6P, una molécula de señalización y reguladora negativa de los niveles de sacarosa. A su vez, la Tre6P coordina el metabolismo de ácidos orgánicos y aminoácidos con la disponibilidad de carbono. En concordancia, se observó un aumento en la acumulación de ácidos orgánicos intermediarios del ciclo de Krebs. También se observaron aumentos en metabolitos importantes que intervienen en la vía del ácido shikímico que da lugar a aminoácidos y otros compuestos aromáticos, y a numerosos metabolitos secundarios. En paralelo, se determinó que a 21 dpi las hojas de plantas infectadas presentan un aumento en los niveles de Aux, JA, ABA, CKs y BRS en sus formas activas e inactivas. Por último, se midió el impacto de la infección en la acumulación de lípidos en hojas de maíz colectadas a campo. Se observó un aumento de ciertos ácidos grasos, en particular de cadena muy larga (VLCFA), aunque el contenido total de lípidos no presentó alteraciones ante la infección. De manera relevante, los VCLFA están involucrados. en la síntesis de hormonas como el JA y compuestos de señalización que participan en la defensa. Nuestros resultados, en conjunto con los datos transcriptómicos, demuestran que la infección por MRCV causa profundas alteraciones en el metabolismo primario y el perfil hormonal de la planta que están, en parte, asociadas con los síntomas de la enfermedad. El genoma del MRCV está formado por diez segmentos de ARN doble cadena que codifican para al menos trece proteínas. Tres de los segmentos son bicistrónicos (S5, S7 y S9). En particular, el S5 posee dos ORFS parcialmente superpuestos y codifica teóricamente para las proteínas P5-1, P5-2 y una tercera proteína de fusión (P5F) producto de un frameshift traduccional +1. Como resultado, la proteína P5F es idéntica a P5-1 en su extremo N-terminal y a P5-2 en su extremo C-terminal. A pesar de que el MRCV replica exclusivamente en el citoplasma, las proteínas virales no estructurales P5-2, P7-1, P7-2 y P8 se localizan en el núcleo de células de insecto. Con el objetivo de determinar la localización subcelular de dichas proteínas en gramíneas y de ahondar en la caracterización de las proteínas codificadas por el S5, se las expresó en protoplastos de arroz fusionadas a GFP y se observó su localización mediante microscopía confocal. Se determinó que P5-1, P5-2, P5F, P7-1, P7-2 y P8 del MRCV se localizan en el núcleo de células vegetales sugiriendo que podrían cumplir un rol en la reprogramación transcripcional del hospedante durante la infección. De acuerdo con esto, se detectó una señal de localización nuclear (NLS) en las proteínas P5-1 y PSF que podría explicar su localización. Además, mediante el uso de mutantes de deleción, se determinó que el extremo C-terminal de P5-2 y P5F y los últimos tres residuos de P5-1 contribuyen a la localización nuclear de estas proteínas. Finalmente, en concordancia con lo reportado para la proteína homóloga del fijivirus RBSDV, P5-2 se localiza exclusivamente en precursores de los cloroplastos denominados etioplastos cuando su extremo C-terminal está bloqueado por la presencia de GFP. Esto es interesante dado que los cloroplastos participan en la defensa antiviral de la planta y, en consecuencia, son un blanco común de muchos virus vegetales. En conclusión, los estudios de localización subcelular de las proteínas mencionadas permitieron avanzar en su caracterización e identificar por primera vez en fijivirus la localización subcelular de la proteína P5F. Setaria viridis es una gramínea de tipo C4, estrechamente relacionada con el maíz que se infecta con MRCV y da lugar a los mismos síntomas. Con el objetivo de desarrollar una plataforma de expresión estable en gramíneas modelo para caracterizar la participación individual de cada proteína viral en la patogénesis y los síntomas, se desarrolló una serie de vectores binarios Gateway que permiten la expresión de las proteínas en estudio fusionadas al epitope 4xcMyc específicamente en el floema o de manera ubicua y se evaluó su funcionalidad mediante ensayos de expresión transitoria en N. benthamiana seguidos por Western blot. A continuación, en el marco de una capacitación en la transformación de S. viridis en el laboratorio del Dr. Danilo Centeno (Universidade Federal do ABC, Brasil), se obtuvieron dos líneas transgénicas que expresan la proteína P7-1 en el floema o de manera ubicua respectivamente. Estas líneas fueron caracterizadas molecularmente, corroborándose la expresión de P7-1, y se obtuvieron líneas homocigotas. Si bien el fenotipo aparente de las plantas transgénicas fue normal, no fue posible ahondar en su caracterización fisiológica dado el escaso número de líneas obtenidas. Actualmente se está trabajando en la obtención de un mayor número de líneas para, evaluar el impacto metabólico y fisiológico de la expresión de P7-1 y otras proteínas virales de localización nuclear en gramíneas. Los resultados de esta Tesis constituyen un avance en la caracterización fisiológica y molecular del impacto del Mal de Río Cuarto en gramíneas y en la identificación de proteínas virales de localización nuclear y/o cloroplástica que podrían intervenir en la reprogramación génica y en consecuencia afectar la producción de síntomas propios de la enfermedad en gramíneas.

Bibliographic Details

Main Author:	Arellano, Sofía Maité
Other Authors:	Del Vas, Mariana
Format:	info:eu-repo/semantics/doctoralThesis biblioteca
Language:	spa
Published:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Subjects:	MAL DE RIO CUARTO VIRUS, SINTOMAS, METABOLISMO PRIMARIO, Tre6P, HORMONAS, PROTEINAS NUCLEARES, CLOROPLASTOS, SETARIA VIRIDIS, GRAMINEAS, SYMPTOMS, PRIMARY METABOLISM, HORMONES, NUCLEAR PROTEINS, CHLOROPLASTS, SETARIA,
Online Access:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7131_Arellano http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n7131_Arellano_oai
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