Glicómica de parásito : estudio de la vía biosintética de esfingolípidos en Trypanosoma cruzi y Plasmodium falciparum

Este trabajo presenta un estudio de la vía biosintética de esfingolípidos en dos protozoarios hemoparásitos: Trypanosoma cruzi (formas epimastigote) y Plasmodium falciparum (estadíos intraeritrocíticos) utilizando espectrometría de masa UV-MALDI-TOF. En una primera etapa se realizó la purificación de la glucosilceramida sintasa, enzima responsable de la transferencia de glucosa desde UDP-glucosa a ceramida, a partir de formas epimastigote de T. cruzi utilizando diferentes pasos cromatográficos. Se demostró que la proteína purificada presentó actividad enzimática específica. A partir de ella fue posible obtener un suero policlonal en ratones con el cual se inmunoprecipitó la enzima activa. Por otra parte, se acopló el anticuerpo a Sepharosa de forma de realizar la inmunopurificación de la enzima en forma más eficiente. Este mismo anticuerpo fue utilizado para la detección de la GCS en otros parásitos. Dado que esta enzima no presenta una secuencia conservada en diferentes sistemas, se realizó un análisis proteómico con la enzima purificada y los resultados fueron comparados en bancos de datos. En una segunda etapa, teniendo en cuenta resultados previos del laboratorio que indicaban que el Tamoxifeno (TAM) inhibe el desarrollo de epimastigotes y tripomastigotes de T. cruzi, se estudió el efecto del TAM sobre el metabolismo de los esfingolípidos no solo en T. cruzi, sino también en P. falciparum y L. amazonensis. Para ello se realizaron incorporaciones metabólicas de ceramidas fluorescentes en cultivos en presencia y ausencia de TAM y se analizaron los esfingolípidos obtenidos por ccd, hplc y espectrometría de masa UV-MALDI-TOF. En la tercera etapa, haciendo uso de la ingeniería metabólica se desarrolló una nueva metodología para la determinación de glicolípidos. Se realizó la incorporación de N-AzGlcNH2 en los estadíos intraeritrocíticos de P. falciparum. Luego de la extracción de los glicolípidos la utilización de las reacciones denominadas ¨Click¨ permitió la unión de un grupo fluorescente que sería utilizado para la detección durante el fraccionamiento así como para el análisis por espectrometría de masa utilizando el grupo fluorescente como fotosensibilizador, disminuyendo el tiempo de análisis e incrementando la sensibilidad con una mínima preparación de la muestra. Este nuevo método resulta de utilidad para cuantificar cambios dinámicos en el patrón de glicosilación y realizar la determinación estructural directa en diferentes sistemas.

Bibliographic Details

Main Author:	Piñero, Tamara Alejandra
Other Authors:	Couto, Alicia S.
Format:	info:eu-repo/semantics/doctoralThesis biblioteca
Language:	spa
Published:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Subjects:	EM MALDI-TOF, T. CRUZI, P. FALCIPARUM, ESFINGOLIPIDOS, TOMAXIFENO, MALDI-TOF M.S., FALCIPARUM, SPHINGOLIPIDS, TAMOXIFEN,
Online Access:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5853_Pinero http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n5853_Pinero_oai
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