Obtención y caracterización del anticuerpo monoclonal Fc-5.01, reactivo con cáncer de mama, melanoma y otros tumores humanos
Con el objeto de producir anticuerpos monoclonales (AMCs) dirigidos contraantígenos (Ags) expresados por células tumorales indiferenciadas, los cualespodrían ser comunes a varias neoplasias, se utilizaron las células IIB-BR-G comoinmunógeno. Esta línea celular de carcinoma mamario presenta característicassumamente indiferenciadas y fue derivada de un tumor primario de mamaaltamente indiferenciado, que no expresa receptores hormonales. Se seleccionóun AMC denominado FC-5.01 (lgG2a), el cual reconoce distintos carcinomashumanos y el 100% de los melanomas malignos. Su reactividad con la mayoría delos tejidos normales es escasa, ya que FC-5.01 reconoce algunas células delsistema neuroendócrino, macrófagos y algunos túbulos contorneados proximalesen el riñón, mayormente con un patrón intracelular. A nivel bioquímico, el Ag reconocido por FC-5.01 es una glicoproteínaheterogénea (banda ancha con un peso molecular de 30-60 kDa) en melanomas ycarcinomas humanos. El epitope reside en el núcleo protéico (25kD) y espresumiblemente conformacional, con puentes disulfuro implicados en elreconocimiento del AMC. En esta Tesis se demuestra que FC-5.01 reacciona conel Ag CD63, inicialmente descripto como un Ag asociado a melanoma, y miembrode la superfamilia Tetraspan o Tetraspaninas. La reactividad de FC-5.01 con CD63 se demostró por Western blot, con ensayos de inmunodepleción con otroanticuerpo anti-CD63 y por análisis de FACS (fluorescence activated cell sorting)de la línea celular de melanoma KM3 (CDGB-negativa) luego de la transfeccióncon la copia genómica de CD63. El epitope reconocido por el AMC FC-5.01 esdiferente del reconocido por otro AMC anti-CD63 (ME491), como se demostró porun radioimmunoensayo de inhibición cruzada. Opuestamente a lo propuesto parael AMC ME491, no se observaron diferencias significativas en Ia expresión de CD63 entre melanomas primarios y metastásicos usando AMC FC-5.01, pormedio de inmunohistoquímica. Por inmunofluorescencia indirecta realizada a 4°C con células vivas, se determinóque el Ag reconocido por FC-5.01 está presente en las membranas plasmáticasde células IIB-BR-G y otras células neoplásicas. En células permeabilizadas, FC-5.01co-localiza con el colorante naranja de acridina en vesículas acídicas (compartimiento lisosomal/endosomal). Por análisis de Scatchard realizado concélulas IB-BR-G, se calculó una constante de afinidad de 1.4 ± 0.4 x 10^7 M^-1 y 2.1x 10^6 sitios antigénicos por célula. El AMC FC-5.01 no media reacciones citotóxicas contra células CD63+ (fijación decomplemento ni ADCC= antibody dependent cellular cytotoxicity), pero el complejo FC-5.01-CD63 es eficientemente internalizado hacia vesículasintracitoplasmáticas, como se observó en un ensayo de inmunofluorescenciaposterior a la incubación a 37°C. El catabolismo celular del AMC unido por lascélulas IIB-BR-G se estudió usando [125I]-FC-5.01. Luego de 18 hs a 37°C, >70%de la radioactividad se encontró en el sobrenadante del cultivo como fragmentosdegradados (TCA-solubles). En células IIB-BR-G se demostró rápida re-expresióndel Ag luego de la internalización. El AMC FC-5.01 disminuyó la migración decélulas CD63+ en un ensayo de cámara de Boyden. Estas propiedades permitiríanel uso del AMC FC-5.01 como un vehículo para dirigir diferentes compuestosdentro de células CD63+. Luego de haber logrado la radioinmunolocalización de xenotransplantes decarcinoma mamario humano creciendo en ratones nude (IIB-BR-GNUDE ) con [125I]-FC- 5.01, se formuló un kit de marcación en un paso, para obtener [99mTc]-FC-5.01,con posible utilidad en diagnóstico por imágenes. Este kit se preparó por reduccióndel AMC con 2-mercaptoetanol y la adición de difosfonato de metileno (MDP)como ligando transquelante. Luego de la marcación con [99mTc] eluído degenerador, las especies marcadas se analizaron por ITLC (instant thin layerchromatography) y HPLC (high performance liquid chromatography). La eficienciade marcación fue superior al 90% y la conservación de la inmunoreactividad severificó con células IIB-BR-G. En el modelo IIB-BR-GNUDE se realizaronbiodistribuciones e imágenes en cámara gamma con [99mTc]-FC-5.01. A las 24 hsla radioactividad se incrementó en los tumores (14.4 ± 5.3 % de la dosis inyectada/gr tumor) y disminuyó en la sangre y los principales órganos, y los tumores seradioinmunodetectaron perfectamente en la cámara gamma. Los controles decalidad demostraron que el kit resulta estable por un período de hasta 120 días. Alícuotas de este mismo kit se inyectaron a dos pacientes con melanoma maligno (0.5 mCi/paciente), y en uno de ellos fue posible localizar, a las 24 hs, unametástasis en un gánglio linfático axilar, que ya había sido detectada por medio detomografía computada. Este kit preparado para radioinmunodetección (RID) in vivopodría ser utilizado en el futuro con fines diagnósticos en pacientes con melanomau otros tumores CD63+. Dados estos resultados, se utilizó el mismo modelo in vivo para experimentos deradioinmunoterapia (RIT). Se investigó la capacidad de [131I]-FC-5.01 paracontrolar el crecimiento de los tumores IIB-BR-GNUDE. En un primer experimento de RIT se observó una inhibición significativa del crecimiento tumoral (p<0.05) enanimales portadores de tumor, tratados con [131I]-FC-5.01(900 μCi) fraccionadosen tres dosis semanales, respecto de los animales control. Se observó ciertogrado de toxicidad hematológica (pérdida de peso corporal, hipoplasia de lamédula ósea, bajos recuentos de leucocitos totales). No se observaronregresiones o curas. También se observó incremento de la probabilidad desupervivencia debida al tratamiento con [131I]-FC-5.01 en uno de los experimentos. El nivel de toxicidad fue disminuído reduciendo la dosis de [131I]-FC-5.01 y poradministración de G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor) comocomplemento de la RIT.
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| Format: | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis biblioteca |
| Language: | spa |
| Published: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
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| Subjects: | ANTICUERPO MONOCLONAL FC-5.01, AG CD63, INTERNALIZACION RADIOINMUNODETECCION, RADIOINMUNOTERAPIA, MAB FC-5.01, CD63 AG, RADIOINMUNODETECTION, RADIOINMUNOTHERAPY INTERNATION, |
| Online Access: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3087_Barrio http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3087_Barrio_oai |
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