Evidencias sobre la existencia de la enzima óxido nítrico sintasa en el espermatozoide murino y su participación en el proceso de fertilización

Virtualmente todas las células de mamíferos están bajo la influencia del radical libre denominado óxido nítrico (NO). Las enzimas responsables de la síntesis del NO se conocen como óxido nítrico sintasas (NOS 6 NO-sintasas). En mamíferos, se han clonado tres isoenzimas de la NO-sintasa. Las isoformas neuronal y endotelial son dependientes de Ca++ y se expresan constitutivamente, mientras que la isoforma inducible es Ca++ independiente y se induce en presencia de lipopolisacáridos y citocinas. Todas las isoformas pertenecen a la farnilia de los citocromos P-450, utilizan L-arginina como sustrato, con oxígeno molecular y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato forma reducida (NADPH) como co-sustratos. Las funciones del NO fueron descriptas primeramente en tres sistemas fisiológicos (vascular, nervioso e inmune) y a partir de dicho estudio se fueron descubriendo funciones del NO en otros sistemas como el reproductor, respiratorio y excretor. En reproducción, se vio que el NO induce la erección peniana, estimula al factor liberador de la hormona luteinizante (LH-RH) y modula la síntesis de prostaglandinas uterinas y ováricas durante la luteólisis en la rata. Sin embargo, hasta el momento no se había descripto la participación del NO en el proceso de fertilización. En el presente trabajo se presentan evidencias de la existencia de la enzima NO-sintasa en la gameta masculina murina y su participación en la fertilización in vitro. Mediante ensayos farmacológicos determinamos que la adición de inhibidores específicos de la NO-sintasa (NG-nitro-L-arginina (NO2-arg) ó NG-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME)) durante el proceso de capacitación in vitro disminuye el porcentaje de ovocitos fertilizados. Esta inhibición es estereoespecífica y depende de la concentración. Dado que el proceso de fertilización se encuentra afectado en presencia de L-NAME y NO2-arg, medimos la motilidad espermática y el patrón de hiperactivación. A los 120 min de incubación, el L-NAME disminuye el porcentaje de espermatozoides mótiles e hiperactivados, mientras que un generador de NO como el nitroprusiato de sodio (NP) acelera estos parámetros de manera concentración dependiente. Considerando que el NO también podía participar en la reacción acrosomal, medimos el efecto del L-NAME sobre espermatozoides reaccionados espontáneamente ó en presencia de un inductor fisiológico como la progesterona. En estos casos, la exocitosis acrosomal también se halla inhibida; la inhibición es estereoespecífica y depende de la concentración. Contrariamente, 0.1 mM de spermine-NONOate (generador de NO) estimula la reacción acrosomal en espermatozoides previamente capacitados a niveles semejantes a los obtenidos con 15 microM de progesterona. Luego de los ensayos farmacológicos, evidenciamos la presencia de la NO-sintasa espermática mediante ensayos inmunológicos. Por inmunofluorescencia indirecta localizamos la NO-sintasa en el acrosoma y en la cola de espermatozoides no capacitados. Durante la capacitación, la fluorescencia desaparece del acrosoma y se mantiene en el flagelo, otorgando a esta enzima un potencial significado fisiológico en el proceso de capacitación y/o de reacción acrosomal. Seguidamente, realizamos ensayos de Western Blot, los cuales nos permitieron demostrar que anticuerpos anti-NOS neuronal, endotelial e inducible reconocen una única fracción proteica de 140 kD bajo condiciones desnaturalizantes y no reductoras en espermatozoides frescos de ratón. Cuando realizamos los experimentos cinéticos, detectamos la presencia de formación de NO, medida como conversión de L-arginina a L-citrulina en espermatozoides intactos y vivos (condiciones in vivo). Los espermatozoides sintetizan NO durante el proceso de capacitación alcanzando un plateau a los 120- 180 min de incubación. Además, la producción de NO depende de la concentración de L-arginina presente en el medio de incubación y es inhibida por L-NAME pero no por aminoguanidina (inhibidor específico para la NO-sintasa de caracter inducible), sugiriendo la existencia de una NO-sintasa espermática de caracter constitutivo. Considerando que en los ensayos farmacológicos evidenciamos la participación de la NO-sintasa del espermatozoide en la exocitosis acrosomal inducida por progesterona, se estudió también la modulación de este esteroide sobre la formación de NO en espermatozoides capacitados. Así, observamos que 15 microM de progesterona estimula directamente la síntesis de NO durante el período ensayado (90-120 min). Basándonos en trabajos realizados en nuestro laboratorio intentamos relacionar al NO con la síntesis de prostaglandinas e hidroxiácidos. Para ello, en primer término, demostramos que los espermatozoides de ratón son capaces de sintetizar PGE2 e hidroxiácido 5-HETE y luego observamos que el NP estimula la síntesis de estos metabolitos en la gameta masculina. Sin embargo, la síntesis basal de prostaglandinas no se ve modificada en presencia de L-NAME. Los resultados de este trabajo evidencian por primera vez la presencia de la NO-sintasa en el espermatozoide de ratón y demuestran su participación en el proceso de fertilización, modulando la motilidad espermática y la exocitosis acrosomal. Podemos afirmar entonces, que el NO sintetizado por la NO-sintasa espermática, es necesario para que el espermatozoide pueda expresar su plena capacidad fertilizante in vitro.

Bibliographic Details

Main Author:	Herrero, María Belén
Other Authors:	Viggiano, Juan Marcelo
Format:	info:eu-repo/semantics/doctoralThesis biblioteca
Language:	spa
Published:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Subjects:	ESPERMATOZOIDE, RATON, OXIDO NITRICO, OXIDO NITRICO SINTASA, REACCION ACROSOMAL, FERTILIZACION, PROSTAGLANDINAS, HIDROXIACIDOS, SPERMATOZOA, MOUSE, NITRIC OXIDE, NITRIC OXIDE SYNTHASE, ACROSOME REACTION, FERTILIZATION, PROSTAGLANDINS, HYDROXYACIDS,
Online Access:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2895_Herrero http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n2895_Herrero_oai
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