Estudios sobre la biosíntesis de uroporfirinógenos : Aislamiento, purificación y propiedades de Porfobilinogenasa, Porfobilinógeno Deaminasa y Uroporfirinógeno III Cosintetasa, de hígado bovino
- Se detalla un método enzimático para la obtención de PBG. - Se describen los métodos de aislamiento y purificación de "Porfobilinogenasa", que logró purificarse 110 veces, de "Porfobilinógeno Deaminasa", purificada 310 veces y de "Uroporfirinógeno III Cosintetasa", que se obtuvo libre de "PBG-D". - Las enzimas fueron igualmente activas en anaerobiosis y en aerobiosis. - Tanto la "PBG-asa" como la "PBG-D" presentaron un pH óptimo a 7,4 en buffer Tris-ClH 0,05 M, observándose que con "PBG-asa" menos purificada si bien la formación total de porfirinógenos fué inferior a pH más ácidos o alcalinos, se estimuló el porcentaje de Urógeno III, indicando o bien una menos sensibilidad de la fracción "I" a variaciones de pH, respecto a la fracción "PBG-D" o que se favorecería cierto estado de asociación-disociación entre subunidades necesario para una mayor actividad. - Las formaciones de Urógeno fueron función lineal tanto en la concentración de "PBG-asa" como de "PBG-D" así como del tiempo; además el agregado de "I" a un sistema con "PBG-D" no varió la velocidad de formación de Urógenos, ni los Urógenos totales, sólo modificó el tipo isomérico. - En gel de almidón, a distinto pH, las tres fracciones se comportaron como entidades proteicas únicas, siendo casi idénticas las movilidades electroforéticas de "PBG-asa" y "PBG-D" en tanto que la de "I" fué relativamente mucho mayor. - Se determinó un P.M. de 40.000 para "PBG-D", 50.000 ± 5.000 para "PBG-asa" y 210.000 ± 21.000 para "I" aunque disminuyendo la fuerza iónica del medio lograron determinarse en este último caso un P.M. 70.000 ± 7.000 y aún menor, indicando que estaría formada por subunidades. - La diálisis prolongada contra agua destiladda mantuvo casi intacta la actividad de "PBG-D" en tanto que convirtió la actividad de "PBG-asa" en "PBG-D" y precipitó la fracción "I". - Por ultrafiltración la "PBG-asa" demostró la presencia de un factor débilmente unido a la enzima y necesario para su actividad. - La "PBG-D" fué estable a calentamientos prolongados a 70°C, pero a esa temperatura se inactiva la "I"; la adición de PBG protegió a ésta última de la inactivación por calor, efecto también ejercido en parte por la "PBG-D" e "I", y además que el PBG se uniría a la fracción "I", explicando así su protección, sugiriendo además ésto, una unión del PBG o el intermediario polipirrólico a la fracción "I" durante la catálisis. - Por calentamiento a tiempos breves se obtuvo una marcada estimulación de la actividad de "PBG-asa" y se sugiere que es debida a la destrucción de un inhibidor termolábil fuertemente unido a la enzima. - Las "PBG-asa" y "PBG-D" se comportaron como enzimas sulfhidrílicas. - Se postula que la formación de Urógenos se produciría en dos etapas, en la segunda intervendrían los -SH y sería la más sensible a los iones amonio. - El efecto estimulante de varios cationes, se atribuyó a un posible fenómeno de asociación-disociación de las enzimas. - Se postuló la unión del PBG a la "PBG-D" por sus restos carboxilatos en base a inhibiciones producidas por varios diácidos. - La "PBG-D" presentó una cinética "Michaeliana", con un Km aparente de 5 x 10^(-6) M y fué inhibida no competitivamente por iones amonio, presentando un Ki = 0,172 M. - La "PBG-asa" presentó una curva de saturación sigmoidea, con una [S0,5] que osciló entre 10-14^(-6) M y un "n" de Hill igual a 2. El perfil de la curva se convirtió en hiperbólico por presencia de iones amonio que transformaron además la actividad de "PBG-asa" en actividad de "PBG-D" variando la [S0,5] a 5 x 10^(-6) M y el "n" = 1, los resultados también obtenidos por diálisis y contra agua destilada y por calentamiento. - Los iones metil, dimetil y trimetil amonio inhibieron la "PBG-asa" en forma similar al ión amonio. - Los nucleótidos de adenina inhibieron a 10^(-2) M en tanto que mostraron ligera activación entre 10^(-3) y 10^(-4) M. - ATP y ADP a concentraciones que inhibieron la formación de Urógeno III modificaron el perfil de la curva de saturación de sigmoideo a hiperbólico, disminuyendo la [S0,5] y tendiendo el "n" de Hill a 1. - Se postula que la "PBG-asa" se comportaría como una enzima alostérica y tendría al menos dos sitios activos que interactuarían positivamente y que los nucleótidos ADP y ATP actuarían como efectores alostéricos.
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| Format: | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis biblioteca |
| Language: | spa |
| Published: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
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| Online Access: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1401_Sancovich http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n1401_Sancovich_oai |
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