Genetics of virulence in potato cyst nematodes

Het centrale thema van het onderzoek was de bestudering van de genetische achtergronden van virulentie en avirulentie van Globoderarostochiensis voor het H 1 resistentiegen in Solanumtuberosum ssp. andigena CPC 1673. Deze monogene resistentie is op dit moment de belangrijkste vorm van resistentie in consumptie- en fabrieksaardappelrassen in West-Europa. Net als bij andere planteparasitaire nematoden werd genetisch onderzoek aan aardappelcysteaaltjes belemmerd door problemen bij het uitvoeren van kruisingsexperimenten. Het genetisch onderzoek dat desondanks werd uitgevoerd kenmerkte zich door tijdrovende experimenten vanwege de diapauze van bijna één jaar, niet goed te controleren massa kruisingen, en het gemis aan populaties met nauwkeurig gedefinieerde niveau's van virulentie. Genetische modellen konden slechts getoetst worden aan de hand van het gedrag van veldpopulaties. Het model van Jones, gebaseerd op het gen-om-gen systeem dat voor het eerst gevonden werd bij de plant/schimmel interactie vlas/roest, beschrijft op een redelijke wijze de virulentie-ontwikkeling van veldpopulaties. In zijn theorie zijn virulente individuen voor het H 1 resistentiegen homozygoot recessief.In de eerste drie hoofdstukken van dit proefschrift zijn de methoden beschreven waarmee binnen een acceptabele tijd genetische experimenten uitgevoerd kunnen worden. Genetische analyses van virulentie in aardappelcysteaaltjes vormen het onderwerp van de laatste twee hoofdstukken.In het eerste hoofdstuk wordt een methode beschreven waarmede achtereenvolgende generaties aardappelcysteaaltjes gekweekt kunnen worden door de diapauze te omzeilen. Hiertoe worden de cysten gekweekt op wortels van aardappelspruiten in Petrischalen met wateragar of in grond en zorgvuldig vochtig gehouden. De larven worden uit de cyst gelokt door de cysten met een scalpel te halveren of voorzichtig door te drukken zonder de eieren te beschadigen ("crushen") en deze vervolgens te incuberen in lokstof. Op deze wijze wordt ongeveer 40% van de cysteinhoud gelokt. Deze behandeling heeft geen nadelige invloeden op de vitaliteit van de larven en de hieruit ontwikkelde mannetjes en vrouwtjes. Dit geldt zowel voor eieren uit cysten gekweekt in Petrischalen als in grond. Op deze wijze is het mogelijk drie tot vijf generaties per jaar in potten te kweken en vijf tot zes generaties in Petrischalen.Een essentieel onderdeel voor het uitvoeren van het genetisch onderzoek was een gestandaardiseerde en nauwkeurige bepaling van de virulentie in populaties (hoofdstuk II). Hiervoor werden cysten in Petrischalen op wortels van aardappelspruiten gekweekt. Optimale resultaten werden verkregen door twee larven per wortelpunt te inoculeren. Het percentage virulente Individuen in diverse populaties werd bepaald door larven op een vatbare en een resistente cultivar te inoculeren en het aantal gevormde vrouwtjes op de resistente cultivar uit te drukken in percentages van het aantal gevormde vrouwtjes op de vatbare cultivar. Deze percentages varieerden aanzienlijk in populaties van pathotypen van zowel G.rostochiensis als G.pallida . Ter bepaling van de nauwkeurigheid van de methode werd een vergelijking gemaakt met de gangbare pathotypetoets op basis van P f /P i bepalingen. De waarden voor de variatiecoëfficient geven duidelijk aan dat de methode In Petrischalen beter geschikt is voor het bepalen van virulentieniveau's dan aan de hand van potexperimenten. Voor verder onderzoek werden de populaties Ro 1 -Mierenbos en Ro 5 -Harmerz uitgekozen met respectievelijk <0,1% en 84.6% virulente individuen voor het H 1 resistentiegen.Het kweken van cysten onder geconditioneerde omstandigheden en de hierboven beschreven techniek maakten het mogelijk om na gecontroleerde enkelvoudige kruisingen virulente en avirulente lijnen voor het H 1 resistentiegen te selecteren (hoofdstuk III). Voor deze kruisingen werden mannetjes In grond en vrouwtjes op wortels in Petrischalen gekweekt. Kruisingen werden uitgevoerd door één mannetje te plaatsen op de gelatineuze matrix van het vrouwtje. In een groot aantal F 2 en F 3 lijnen werden de virulentieniveau's bepaald. Uit populatie Ro 1 -Mierenbos en Ro 5 -Harmerz werden respectievelijk een avirulente en een virulente lijn geselecteerd, die gebruikt werden voor een nadere genetische analyse.Reciproke kruisingen tussen individuen van een avirulente en een virulente lijn gaven avirulente nakomelingen (F 1 ). Zelfbevruchting van de F 1 leverde in de F 2 25% virulente en 75% avirulente individuen. Deze 1:3 uitsplitsing betekent dat virulentie recessief (a) is; virulente individuen zijn homozygoot recessief (aa), en avirulente individuen homozygoot dominant (AA) of heterozygoot (Aa). Bovendien is (a)virulentie niet geslachtsgebonden (hoofdstuk IV).Met behulp van de virulente en de avirulente lijn en de heterozygote F 1 in combinatie met een betrouwbare techniek om mannetjes te verzamelen werd het effect van heterozygotie op de vorming van mannetjes en vrouwtjes bestudeerd. Zowel de homozygote (AA) als de heterozygote (Aa) avirulente larven kunnen zich op cultivars met het H 1 gen niet tot vrouwtjes ontwikkelen maar wel tot mannetjes. Heterozygote avirulente mannetjes waren enigszins in het voordeel in vergelijking met homozygote avirulente mannetjes. Dit verschil is echter te klein om effect te kunnen hebben op populatie-genetisch niveau (hoofdstuk V).Deze genetische analyse bewijst dat er een klassieke gen-om-gen relatie bestaat tussen (a)virulentie in G.rostochiensis en het H 1 resistentiegen en opent de weg voor het opsporen van het (a)virulentiegen en mogelijk ook het H 1 resistentiegen. Met behulp van "single copy" DNA probes kunnen RFLP's (Restriction Fragment Length Polymorphism) opgespoord worden die nauw gekoppeld zijn met het (a)virulentiegen. Hiertoe is de F 1 (Aa) van een virulente (aa) en avirulente (AA) teruggekruist met de virulente ouderlijn (aa). De T 1 is vervolgens opnieuw teruggekruist (T 2 ) met de virulente ouder om virulente lijnen te selecteren voor het H 1 resistentiegen in cultivar 'Saturna' (Figuur l). Deze kruising gaf de gewenste 1:1 uitsplitsing te zien. Er worden nu ongeveer 300 T 2 lijnen vermeerderd. Een set discriminerende probes voor de ouderlijnen is in ontwikkeling. In het geval de RFLP's niet zijn gekoppeld met (a)virulentie, zullen in de 300 T 2 lijnen de DNA-banden van beide ouderlijnen aanwezig zijn. Geldt echter koppeling dan wordt alleen het DNA-patroon van de virulente ouderlijn verkregen, tenzij er recombinatie heeft plaatsgevonden. Het percentage recombinanten geeft waardevolle informatie voor het construeren van koppelingskaarten. Ook kan de fysische afstand tussen een aantal RFLP's die nauw gekoppeld zijn met het (a)virulentiegen worden bepaald met behulp van "Pulsed Field Electrophoresis". Dit is een belangrijke stap op weg naar het isoleren en karakteriseren van dit (a)virulentiegen in het aardappelcysteaaltje, wat vervolgens kan leiden tot localisatie van het complementaire resistentiegen in de plant.Tot slot, het hier samengevatte onderzoek betreft een viertal methodieken die ondanks hun eenvoud baanbrekend zijn geweest voor het uitvoeren van genetisch onderzoek aan aardappelcysteaaltjes: (i) het opkweken van vier tot vijf generaties aardappelcysteaaltjes per jaar, (ii) een accurate methode voor het bepalen van het aantal virulente individuen in een populatie, (iii) het kweken van cysten op aardappelwortels in Petrischalen, en (iv) het uitvoeren van gecontroleerde kruisingen tussen één vrouwtje en één mannetje. Dit veredelingswerk resulteerde in de selectie van een avirulente en een virulente lijn met behulp waarvan het genetisch bewijs werd geleverd voor het bestaan van een gen-om-gen relatie tussen (a)virulentie in G.rostochiensis en het H 1 resistentiegen.

Bibliographic Details

Main Author:	Janssen, R.
Other Authors:	van der Wal, A.F.
Format:	Doctoral thesis biblioteca
Language:	English
Published:	Landbouwuniversiteit Wageningen
Subjects:	genetics, globodera rostochiensis, heritability, heteroderidae, inheritance, plant pests, potatoes, pratylenchus, solanum tuberosum, tylenchidae, aardappelen, genetica, overerving, plantenplagen,
Online Access:	https://research.wur.nl/en/publications/genetics-of-virulence-in-potato-cyst-nematodes
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!