Caracterização molecular e expressão em bactéria de uma cisteínoprotease de Theobroma cacao-Moniliophthora perniciosa

O fungo Moniliophthora perniciosa (Stahel) Singer, agente causador da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao L.), é atualmente o maior problema fitopatológico das regiões produtoras de cacau. A complexidade do patossistema cacau-M. perniciosa e os prejuízos causados pela doença motivaram estudos genômicos e proteômicos do fungo e da interação. Em bibliotecas de cDNA das interações T. cacao-M. perniciosa resistente e susceptível, sequenciadas na UESC, foram detectados fragmentos gênicos de diferentes classes de proteases. Esse trabalho objetivou a caracterização molecular do gene TcCysPr04 e a expressão da respectiva proteína em bactéria. Análises de bioinformática revelaram que o gene possui uma ORF de 526 pb, que codifica uma proteína com 171 aminoácidos, com PM estimado de 19,1 kDa e pI de 8,6. Análises com o programa signalP 3.0 indicou a presença de um peptídeo sinal com provável sitio de clivagem entre os aminoácidos 19 e 20, e, análises com os programas TargetP e PSORT indicaram a provável secreção da proteína para o apoplasto ou localização vacuolar, como ocorre com cisteíno proteases do grupo das aleurinas. A sequencia aminoacídica de TcCisPr04 foi alinhada com outras proteases do gene bank e agrupou com o domínio inibitório de cisteíno-proteases envolvidas em reação de hipersensibilidade a patógenos. Análise no Pfam e ProDom indicou que o domínio inibitório contém 56 aminoácidos, localizados entre as coordenadas 56 e 112. O domínio inibitório da TcCisPr04 foi clonado em pET28a, sob controle do promotor da T7 RNA Polmerase. A proteína foi expressa na estirpe de E. coli, BL21(DE3), e induzida com IPTG a 1 mM. A expressão heteróloga do domínio inibitório foi visualizada em gel SDS-PAGE 15% e uma banda com massa molecular esperada de aproximadamente 19 kDa foi observada. A proteína purificada por cromatografia em colunas contendo níquel e não exibiu atividade inibitória sobre a papaína do mamão em ensaios com o substrato cromogênico BApNA. Além disso, a proteína também não afetou o crescimento de hifas do fungo M. perniciosa. Ensaios ainda precisam ser realizados para avaliar se esta proteína é da classe regulatória dos zimógenos ou esse domínio inibitório exibe interação com o domínio catalítico, mesmo após clivagem proteolítica.

Bibliographic Details

Main Authors:	Santana Cardoso, Thyago Hermylly, Micheli, Fabienne, Pirovani, Carlos Priminho, De Mattos Cascardo, Julio Cézar, Da Silva Gesteira, Abelmon
Format:	conference_item biblioteca
Language:	por
Published:	s.n.
Subjects:	H20 - Maladies des plantes, F30 - Génétique et amélioration des plantes,
Online Access:	http://agritrop.cirad.fr/568356/ http://agritrop.cirad.fr/568356/1/document_568356.pdf
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