Aislamiento, clonaje y caracterización biológica del ADN complementario de la Hormona Hiperglucemiante de Crustáceos de Litopenaeus schmitti (Decapoda: Penaeidae)

El desarrollo alcanzado en la camaronicultura hasta el presente exige estudios cada vez más novedosos en vista a enfrentar nuevos retos. En este sentido resulta necesario el conocimiento de la estructura-función de los neuropéptidos de la familia de la Hormona Hiperglucemiante de Crustáceos (familia HHC). Ella juega un importante papel en el metabolismo y la fisiología influyendo directamente sobre la muda, el crecimiento, la reproducción, el metabolismo de la glucosa y lípidos, entre otras. La Hormona Hiperglucemiante de Crustáceos (HHC) es el componente mayoritario de la familia HHC y el único neuropéptido aislado y secuenciado hasta el presente. Ella es una hormona pleiotrópica y su función principal es regular el nivel de glucosa en la hemolinfa. La purificación de los neuropéptidos a partir de su fuente natural de expresión requiere de cientos de pedúnculos oculares de camarón. Mientras que la obtención del ADN complementario (ADNc) que codifica para la HHC de pedúnculo ocular es una alternativa para obtener la HHC en cantidades suficientes y biológicamente activa para posteriores estudios biológicos en camarones peneidos. En este trabajo, conociendo la secuencia aminoacídica de la HHC de Litopenaeus schmitti, se diseñaron oligonucleótidos degenerados capaces de aislar el ADNc de la HHC en camarones peneidos. Como resultado se obtuvo por primera vez el ADNc de 216 pares de bases que codifica para la región madura de la HHC de L. schmitti. Los análisis de secuencia del fragmento amplificado por TR-RCP revelaron una alta homología con otras HHC en camarones peneidos. El análisis de la expresión tejido-específica de la HHC por Northern blot, mostró que el ARN mensajero (ARNm) de la HHC está presente en el pedúnculo ocular pero no se encuentra en músculo y estómago. Sin embargo, el análisis semicuantitativo de TR-RCP reveló su presencia en los tres tejidos. Para contar con suficiente cantidad de la HHC biológicamente activa, en este trabajo se clonó el ADNc (216pb) de la HHC de L. schmitti en el vector de expresión pTYB2. Como resultado se obtuvo la HHC recombinante expresada en E. coli como proteína de fusión a la inteina y formando parte de los cuerpos de inclusión. La purificación de la proteína de fusión se realizó por el método de electroelusión. La HHC recombinante mostró capacidad para incrementar el nivel de glucosa en la hemolinfa in vivo en Litopenaeus vannamei. Los animales con ablación bilateral del pedúnculo ocular inyectados con la HHC recombinante mostraron una actividad hiperglicémica semejante a la mostrada por el grupo control positivo (animales sin ablación inyectados con PBS). Mientras que, se observaron diferencias significativas en la concentración de glucosa respecto a los grupos control negativo que consistieron en animales con ablación bilateral del pedúnculo ocular inyectados con la proteína inteina (p<0.05) o PBS (p<0.05). Por otra parte, en nuestro trabajo nos propusimos comprobar la funcionalidad del novedoso mecanismo del ARNi en camarón in vivo, por primera vez, pues constituye el primer paso para determinar la función de genes desconocidos. Para ello se sintetizó un ARN doble cadena (ARNdc) a partir del ADNc de la HHC de L. schmitti. Su capacidad para silenciar la expresión del gen de la HHC se determinó por análisis de su función biológica principal y del transcrito de la HHC. Se constató la disminución del nivel de glucosa en la hemolinfa respecto a los grupos controles negativos tratados con un ARNdc no relacionado (p<0.05) y solución salina (p<0.05). Los resultados de Northern blot y RT-PCR semicuantitativo mostraron el silenciamiento del ARNm de la HHC 24 horas post-inyección solamente en el grupo tratado con ARNdc de la HHC. Los resultados obtenidos son el comienzo de los estudios básicos de los neuropéptidos de la familia HHC. La completa caracterización de todos sus miembros será una importante herramienta para la manipulación controlada de la reproducción en camarones peneidos.

Bibliographic Details

Main Author:	Yuliet Morera Darias
Other Authors:	Ramos Trujillo, L.
Format:	Theses and Dissertations biblioteca
Language:	Spanish / Castilian
Published:	2009
Subjects:	Marine shrimp culture, Anatomical structures, Functional analysis,
Online Access:	http://hdl.handle.net/1834/5528
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