Impactos do uso S-adenosil-L-homocisteína (SAH) como agente desmetilante de DNA no sistema de cultivo celular de bovinos.

Fatores epigenéticos são responsáveis por controlar a expressão de genes e diferenciação durante a vida celular. Dentre eles, a metilação do DNA é o mais estudado. Cada tipo celular possui um padrão epigenético altamente especializado. Após a fecundação natural ou clonagem por transferência nuclear (TNCS), um padrão epigenético préexistente deve ser apagado e restabelecido para garantir o correto desenvolvimento embrionário. Porém, nos clones, essa reprogramação é ineficiente mas é possível que o uso de substâncias desmetilantes de DNA utilizadas durante o cultivo celular de células doadoras de núcleo possa desmetilar o DNA, aumentando a eficiência da técnica. O objetivo desse estudo foi avaliar, em fibroblastos bovinos, o efeito da S-Adenosil-L-Homocisteína (SAH) na viabilidade celular, metilação de DNA e expressão do transcrito específico do gene XIST responsável pela inativação do cromossomo X. Células foram cultivadas em meio de cultivo DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium -Gibco®), suplementado com 0.5mM, 1.0mM, 1.5mM e 2.0mM de SAH (Sigma®), incubado a 39°C e 5% de CO2. O padrão de metilação do DNA foi avaliado através do sequenciamento de sequências de DNA tratadas com bissulfito de sódio, usando o kit EZ DNA methylation Kit" (ZymoResearch®), para converter citosinas não metiladas. O RNA total das células foi extraído com o kit RNeasy Plus Micro kit (Qiagen®) e o transcrito de XIST foi quantificado por PCR em tempo real, usando GAPDH e CYC-A como controles endógenos. O número de células foi comparado entre o grupo controle e os grupos tratados com 0.5mM, 1.0mM, 1.5mM e 2.0mM de SAH e a metilação do DNA e a expressão entre o grupo controle e o grupo tratado com 2.0mM de SAH. Não houve diferença na viabilidade celular, metilação de DNA e expressão gênica entre os tratamentos. O grupo controle apresentou 100% de sequências hipermetiladas e 87,58% de metilação e o grupo tratado com 2.0mM de SAH apresentou 92,86% de sequências hipermetiladas e 82,35% de metilação. O uso do SAH como agente desmetilante no cultivo celular é uma alternativa viável que continua sendo estudada. Acredita-se que um processo de desmetilação é induzido pelo uso do SAH durante o cultivo celular, contribuindo para o aumento da eficiência da TNCS. Contudo, é necessário avaliar outras concentrações e diferentes tempos de cultivo com o SAH.

Bibliographic Details

Main Author:	AZEVEDO, J. M. de
Format:	Teses biblioteca
Language:	pt_BR por
Published:	2014-08-20
Subjects:	Fibroblastos, SAH, Metilação de DNA, XIST, Bovino,
Online Access:	http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/handle/doc/992943
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