Caracterización funcional y celular de un nuevo gen recientemente clonado en hipófisis

Caracterización funcional y celular de un nuevo gen recientemente clonado en hipófisis

La sumoilación, un sistema de modificación post-traduccional reversible similar a la ubiquitinación, consiste en una cascada enzimática que lleva a la conjugación de SUMO a proteínas blanco. Esta modificación regula procesos como el tráfico intracelular, degradación de proteínas, estructura y replicación cromosómica y regulación de la transcripción. En este trabajo se caracteriza a R-SUME (por “RWDcontaining SUMoylation Enhancer), un nuevo gen con un dominio RWD, clonado de una línea celular hipofisaria sobre-expresora de gp130 con un potencial tumorigénico y angiogénico aumentado. En células en cultivo, R-SUME se localiza tanto en núcleo como en citoplasma e inhibe la actividad transcripcional de Stat3, lo cual podría funcionar como un mecanismo de feedback negativo sobre gp130. Dada la similitud estructural entre el dominio RWD y la conjugasa de SUMO Ubc9, se estudiaron los efectos de R-SUME sobre la cascada de sumoilación. Se observa por Western blot que R-SUME aumenta la conjugación de proteínas por SUMO-1, -2 y –3, efecto que depende de Ubc9. En experimentos de pull-down, R-SUME interactúa con una proteína de fusión GST-Ubc9 aún en ausencia de SUMO, sugiriendo una interacción directa. Esto concuerda con la colocalización de R-SUME con Ubc9 en el núcleo observada por microscopía de fluorescencia. R-SUME estimula la sumoilación de IκB, un blanco de SUMO conocido, in vivo e in vitro, lo cual lleva a una inhibición de la actividad transcripcional de NF-κB. En conjunto, estos resultados indican que R-SUME cumple un rol importante en la regulación de la sumoilación de proteínas, lo cual puede tener un efecto significativo en numerosos procesos celulares.

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Main Author: Carbia Nagashima, Alberto Nicolás
Other Authors: Arzt, Eduardo
Format: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis biblioteca
Language:spa
Published: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Subjects:GP 130, NF-KB, RWD, SUMO, SUMOILACION, UBC9, TUMORIGENESIS, SUMOYLATION,
Online Access:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4094_CarbiaNagashima
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n4094_CarbiaNagashima_oai
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spelling oai:RDI UBA:aextesis:tesis_n4094_CarbiaNagashima_oai2023-08-03 Arzt, Eduardo Carbia Nagashima, Alberto Nicolás 2006 La sumoilación, un sistema de modificación post-traduccional reversible similar a la ubiquitinación, consiste en una cascada enzimática que lleva a la conjugación de SUMO a proteínas blanco. Esta modificación regula procesos como el tráfico intracelular, degradación de proteínas, estructura y replicación cromosómica y regulación de la transcripción. En este trabajo se caracteriza a R-SUME (por “RWDcontaining SUMoylation Enhancer), un nuevo gen con un dominio RWD, clonado de una línea celular hipofisaria sobre-expresora de gp130 con un potencial tumorigénico y angiogénico aumentado. En células en cultivo, R-SUME se localiza tanto en núcleo como en citoplasma e inhibe la actividad transcripcional de Stat3, lo cual podría funcionar como un mecanismo de feedback negativo sobre gp130. Dada la similitud estructural entre el dominio RWD y la conjugasa de SUMO Ubc9, se estudiaron los efectos de R-SUME sobre la cascada de sumoilación. Se observa por Western blot que R-SUME aumenta la conjugación de proteínas por SUMO-1, -2 y –3, efecto que depende de Ubc9. En experimentos de pull-down, R-SUME interactúa con una proteína de fusión GST-Ubc9 aún en ausencia de SUMO, sugiriendo una interacción directa. Esto concuerda con la colocalización de R-SUME con Ubc9 en el núcleo observada por microscopía de fluorescencia. R-SUME estimula la sumoilación de IκB, un blanco de SUMO conocido, in vivo e in vitro, lo cual lleva a una inhibición de la actividad transcripcional de NF-κB. En conjunto, estos resultados indican que R-SUME cumple un rol importante en la regulación de la sumoilación de proteínas, lo cual puede tener un efecto significativo en numerosos procesos celulares. Sumoylation, an ubiquitin-like reversible post-translational modification system, is an enzimatic cascade leading to the covalent attachment of SUMO to its target proteins. This modification regulates cellular processes including protein trafficking and degradation, chromatin structure and regulation of transcription. In this work, we characterize R-SUME (for RWD-containing Sumoylation Enhancer), a new RWD domain-containing gene cloned from a pituitary cell line overexpressing gp130 and with an increased tumorigenic and angiogenic potential. In cultured cell lines, R-SUME localizes to both nucleus and cytoplasm and inhibits Stat3 transcriptional activity, which could be a negative feedback mechanism on gp130. Given the structural similarity between RWD domain and SUMO conjugase Ubc9, the effects of R-SUME on the sumoilation cascade were studied. R-SUME enhances SUMO-1, 2 and 3 conjugation as observed by Western blot analysis and this effect depends on Ubc9. In pull-down experniments, R-SUME interacts with a GST-Ubc9 fusion protein even in the absence of SUMO, suggesting a direct interaction. This is in agreement with the colocalization of R-SUME with Ubc9 in the nucleus observed by fluorescent confocal microscopy. R-SUME increases the sumoylation of IκB, a known SUMO target, in vivo and in vitro (whereas a structural mutant of R-SUME inhibits sumoylation), leading to an inhibition of NF-κB transcriptional activity. Together, these results indicate an important role of R-SUME regulating SUMO conjugation, and therefore many critical regulatory pathways. Fil: Carbia Nagashima, Alberto Nicolás. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4094_CarbiaNagashima spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar GP 130 NF-KB RWD SUMO SUMOILACION UBC9 TUMORIGENESIS SUMOYLATION Caracterización funcional y celular de un nuevo gen recientemente clonado en hipófisis Functional and cellular characterization of a new gene recently cloned in the pituitary info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n4094_CarbiaNagashima_oai

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