Caracterización de la expresión y actividad de las fosfatasas de Serina y treonina durante el desarrollo del sistema nervioso central : función de la Calcineurina

El objetivo en esta tesis fue caracterizar el comportamiento de las fosfatasas de serinay treonina (STPasas) durante el desarrollo del sistema nervioso. Como modelo experimentalse empleó en primera instancia el desarrollo postnatal del cerebelo de ratón, ya que duranteeste período se dan numerosos procesos, como el crecimiento axonal, la formación desinapsis y la apoptosis, en los cuales las distintas STPasas podrían llegar a estar involucradas. Para caracterizar la expresión de los ARNm de las fosfatasas, se diseño una nueva estrategia, SSDD (Single-Strand Differential Display), la cual nos permitió determinar como era laexpresión de los distintos mensajeros a distintas edades. Esta técnica no solo nos permitióobservar que cada una de las STPasas detectadas presenta una expresión diferencial, sino quetambién identificar una nueva variante de splicing de la isoforma gamma de la PP1. Estatécnica también fue empleada con éxito para el estudio de STPsas en tumores del sistemanervioso, pudiéndose observar que tanto la expresión de la isoforma alfa de la PP1 como delas isoformas alfa y beta de la PP2A era mayor en tumores de índole maligna que enbenignos. Además, se detectó por primera vez la isoforma gamma de la calcineurina (CaN Aγ) en tumores del sistema nervioso. Durante el desarrollo del cerebelo, se observó que PP2A no muestra variacionessignificativas ni en la expresión de proteínas ni en la actividad fosfatasa que posee. Por otrolado, PP1 sí muestra diferencias no solo en la expresión de proteínas, donde se observa unaumento a P13 y una disminución posterior a P20, sino también en lo que respecta a suactividad, cuyo incremento coincide con el período en el cual se empiezan a formar lassinapsis entre los axones de las células grano y las espinas dendríticas de las células de Purkinje. En el mutante cerebeloso staggerer, en el cual se encuentran afectadas las célulasde Purkinje y no se produce la estabilización sináptica, se encontró que los niveles proteicosde PP1 no disminuyen a P20 como ocurre en el cerebelo normal, y que la actividad no seincrementaba. Por otro lado, la fosfatasa que mostró mayores variaciones durante eldesarrollo fue la calcineurina. Específicamente, los niveles de proteínas de la isoforma CaN Aα se incrementan gradualmente con el tiempo, lo cual coincide con el período de formaciónde sinapsis. En este período además, se produce un incremento en la actividad de lacalcineurina. En el mutante staggerer, los niveles de esta isoforma son similares hasta P11,pero después no se incrementan como sucede en el ratón normal. La actividad fosfatasa en elmutante decae también a partir de esta edad. Con el fin de estudiar con mayor detalle la función de la calcineurina, se estudió loque ocurría en distintos cultivos del sistema nervioso (células PC12, células NT2 y cultivosprimarios de células grano). Para esto se incubaron los distintos cultivos con inhibidores de lacalcineurina y con oligonucleótidos antisentido contra las dos isoformas. En todos los casosse observó que, tanto la inhibición de la actividad como de la expresión, particularmente de laisoforma CaN Aβ, provocaba que las células murieran por apoptosis, independientemente delestadío de diferenciación en el que ellas se encontraran. Este proceso estaba relacionado conun aumento en los niveles de Bax y una disminución de Bad. Particularmente en el caso delas células NT2, se pudo observar que el aumento de la expresión de Bax coincidía con unincremento en la translocación de la proteína al núcleo, mientras que la disminución de Badlo hacía con la aparición de “parches” en el citoplasma, lo que es indicativo de unatranslocación a mitocondria. Posteriormente se estudió lo que ocurría con estas proteínas pro-apoptóticas en elmutante staggerer, el cual presentaba una muy baja actividad de calcineurina. Bad no mostróvariaciones pero los niveles de Bax a P20 aumentaron considerablemente. Todos estosresultados sugieren que la inhibición de la expresión o de la actividad de la calcineurinaocasiona que las células entren en apoptosis por un mecanismo que involucra, por lo menos,un aumento en los niveles de Bax.

Bibliographic Details

Main Author:	Vilá Ortiz, Guillermo
Other Authors:	Santa Coloma, Tomás
Format:	info:eu-repo/semantics/doctoralThesis biblioteca
Language:	spa
Published:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Subjects:	FOSFATASAS DE SERINA Y TREONINA, DESARROLLO, CEREBELO, CULTIVOS CELULARES, CALCINEURINA, APOPTOSIS, SERINE/THREONINE PHOSPHATASES, DEVELOPMENT, CEREBELLUM, CELL CULTURES, CALCINEURIN,
Online Access:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3456_VilaOrtiz http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3456_VilaOrtiz_oai
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