Exploring and exploiting the RNA genome of tomato spotted wilt virus

Het bronsvlekkenvirus virus van de tomaat, tomato spotted wilt virus (TSWV) was voor lange tijd de grote onbekende onder de plantevirussen. Ondanks het feit dat het een economisch erg belangrijk plantepathogeen is, kwam het onderzoek aan dit virus pas relatief laat op gang. Dit wordt in de eerste plaats veroorzaakt door het feit dat het een labiel en moeilijk hanteerbaar virus is. In de tweede plaats is TSWV pas echt onderwerp van intensieve studie geworden nadat één van de belangrijkste vectoren voor verspreiding, de Californische thrips ( Frankliniellaoccidentalis ) zich vanuit de Noord-Amerikaanse westkust is gaan verspreiden over het noordelijk halfrond en wellicht de gehele wereld. Daarnaast is TSWV een wetenschappelijk interessant virus. De virusdeeltjes (met een diameter van 80- 110 nm) bestaan uit nucleocapsiden, omgeven door een lipidemembraan, die bedekt is met 'spikes'. Het genoom bestaat uit drie enkelstrengs lineaire RNA segmenten, die S (small), M (medium) en L (large) RNA worden genoemd. De complexe morfologie van de virusdeeltjes samen met het feit dat er nagenoeg geen moleculaire gegevens zijn, heeft lange tijd een goede classificatie in de weg gestaan.Dit proefschrift beschrijft een moleculair genetisch onderzoek aan TSWV, met als doel enerzijds de moleculaire eigenschappen en de taxonomische positie te bepalen en anderszijds een bijdrage te leveren aan de beheersing van dit schadelijke virus.De hoofdstukken drie, vier en vijf beschrijven de moleculaire clonering van het virale genoom en de vaststelling van de nucleotidenvolgorde van respectievelijk het kleinste (S) en het grootste (L) genomische RNA segment. De nucleotidenvolgorde van het middelgrote (M) RNA segment bleef bij dit onderzoek buiten beschouwing.Het TSWV S RNA is 2916 nucleotiden lang en bevat twee genen in een zogenaamde 'ambisense' rangschikking. Op de virale RNA streng ligt een non-structureel eiwit (NSs, 52,4K) gecodeerd, terwijl het nucleocapside eiwit (N, 28,8K) op de viraal complementaire RNA streng gecodeerd ligt. Voor beide eiwitten kan geen significante aminozuur sequentie homologie gevonden worden met enig ander eiwit. De twee genen komen tot expressie middels de synthese van subgenomische mRNA moleculen. De regio tussen beide genen, rijk aan A en U residuen, kan gevouwen worden in een haarspeld structuur en bevat waarschijnlijk belangrijke signalen voor transcriptie door het virale polymerase.Het TSWV L RNA is 8897 nucleotiden lang en heeft een negatieve polariteit, met één groot open leesraam. op de viraal complementaire streng. Het voorspelde genproduct bevat een vijftal geconserveerde aminozuur sequentie motieven, die typerend zijn voor alle polymerasen met RNA als matrijs. Dit maakt het erg waarschijnlijk dat het L RNA codeert voor het virale RNA polymerase (L, 331,5K). Zoals beschreven in de hoofdstukken 3 en 5, werd een verkort L RNA molecuul aangetroffen in het gebruikte TSWV isolaat. Verkorte L RNA segmenten zijn in diverse isolaten aangetroffen, die middels mechanische inoculatie in stand worden gehouden.Zowel het S als het L RNA bezitten complementaire uiteinden. Deze vormen waarschijnlijk de herkenningsplaatsen voor het virale RNA polymerase. Vergelijking met andere RNA virussen laat zien dat er homologie bestaat tussen de terminale sequenties van TSWV en die van Thogoto virus, een door teken overgebracht orthomyxovirus. Dit kan mogelijk duiden op evolutionaire verwantschap tussen TSWV en de Orthomyxoviridae. De verkregen moleculaire gegevens samen met de morfologische eigenschappen laten zien dat TSWV behoort tot de familie der Bunyaviridae, een grote groep door arthropoden verspreide virussen. De structuur en genetische organisatie van het TSWV genoom lijkt sterk op dat van phlebo- en uukuvirussen, die twee genera vormen binnen deze grote virusfamilie. Omdat er geen serologische verwantschap bestaat tussen TSWV en de andere bunyavirussen en omdat er ook geen homologie in nucleotiden- of aminozuurvolgorde bestaat (behalve de geconserveerde 'polymerase motieven' in de L eiwitten natuurlijk), moet TSWV beschouwd worden als de vertegenwoordiger van een nieuw genus binnen de Bunyaviridae. Recentelijk is de genus naam tospovirus geaccepteerd door de ICTV (Internationaal Comité voor Taxonomie van Virussen).Met behulp van de verkregen cDNA clonen en de nucleotidenvolgorde informatie is het thans mogelijk geworden om gevoelige detectiesystemen te onwikkelen, die een aanvulling kunnen zijn op de reeds bestaande serologische detectiemethoden. Hoofdstuk zes gaat over de onwikkeling van een detectiemethode gebaseerd op 'dot blot' hybridisatie met behulp van radioactief gemerkte synthetische RNA transcripten en van een methode gebaseerd op de 'polymerase chain reaction' (PCR). Respektievelijk 1 en 0,1 picogram viraal nucleinezuur kon met deze methoden worden gedecteerd in TSWV-geïnfecteerd plantemateriaal. In principe zijn beide methoden bruikbaar voor vroegtijdige TSWV diagnose.Door de beschikbaarheid van gecloneerde virale genen lag het vervolgens voor de hand te zoeken naar mogelijkheden voor resistentie tegen TSWV, door introductie van virale genen in waardplanten. Dit omdat tot op heden geen bruikbare natuurlijke resistentie genen tegen dit virus gevonden zijn. Gekozen is voor het tot expressie brengen van het TSWV N gen in tabak, omdat voor andere negatief-strengs RNA virussen vastgesteld was dat de hoeveelheid intracellulair N eiwit een sterk regulerende rol speelt in de virale infectiecyclus. De hoeveelheid vrij, cytoplasmatisch N eiwit bepaalt immers of er transcriptie danwel replicatie plaatsvindt door het virale polymerase. Wellicht zal een grote hoeveelheid N eiwit in transgene planten leiden tot voortijdige en abortieve replicatie van binnenkomend viraal RNA. De experimenten beschreven in hoofdstuk zeven laten zien dat een aantal transgene tabakslijnen verkregen werden die inderdaad verminderd vatbaar geworden zijn voor TSWV. Hoewel nog erg veel onderzoek nodig is, vormen deze resultaten een eerste en belangrijke stap op weg naar de beheersing van TSWV.