Genetic analysis of Aspergillus niger

Dit proefschrift handelt over genetische analyse van de voor de biotechnologie belangrijke schimmel Aspergillusniger . A.niger is een imperfecte schimmel, met andere woorden A.niger heeft geen geslachtelijk stadium, en mist daardoor meiotische recombinatie. Toch is genetisch onderzoek aan imperfecte schimmels mogelijk en wel op basis van af en toe optredende mitotische recombinatie in heterozygote diploiden. Twee typen recombinanten zijn hierbij van belang. Ten eerste kunnen door opeenvolgende non-disjunctie gebeurtenissen haploiden ontstaan die recombinant zijn als gevolg van hergroepering van chromosomen. Dergelijke recombinanten geven informatie omtrent de koppelingsgroep ('chromosoom') waartoe een bepaald gen behoort. Ten tweede kunnen door overkruisingen tussen homologe chromosomen diploide recombinanten ontstaan. Deze recombinanten kunnen worden gebruikt voor het in kaart brengen van genen die tot dezelfde koppelingsgroep behoren. De belangrijkste vereisten voor de genetische analyse van A.niger zijn: (1) De aanwezigheid van genetische markers. (2) Mogelijkheid tot selectie van de (zeldzame) recombinanten. (3) De mogelijkheid tot karakterisering van de recombinanten. Het primaire doel van het hier beschreven onderzoek was het ontwikkelen en toepassen van genetische technieken voor de constructie van een genetische kaart van A.niger . De genetische kaart kan vervolgens worden gebruikt voor genetisch onderzoek en bij de veredeling van stammen. De gevolgde strategie was tweeledig. Allereerst zijn methoden (verder) ontwikkeld waarmee genetische analyse op grond van de reeds aanwezige markergenen mogelijk is. Daarnaast zijn nieuwe markers geintroduceerd door mutatie en transformatie.In hoofdstuk 2 wordt een procedure beschreven voor de verrijking van auxotrofe recombinanten. De methode is gebaseerd op selectieve afdoding van geimmobiliseerde kiemende conidiosporen door celwand afbrekende enzymen (Novozym 234). De optimale condities voor deze 'Novozym-verrijking' zijn in simulatie experimenten bepaald. De methode is gebruikt voor het in kaart brengen van auxotrofe markers ten opzichte van het centromeer op chromosoom V.Hoofdstuk 3 beschrijft de isolatie en karakterisatie van chloraatresistente mutanten alsmede het gebruik ervan voor genetische analyse van A.niger . Deze resistentie mutaties behoren tot negen verschillende complementatiegroepen (plus één overlappende). De mutanten zijn onderverdeeld in drie klassen op grond van groei op verschillende stikstofbronnen. De chloraatresistentie genen liggen verspreid over zes koppelingsgroepen. Drie van deze markers bleken ongekoppeld met markers van de zes tot dan toe bekende koppelingsgroepen en leverden bewijs voor het bestaan van nog twee chromosomen in A.niger (n=8). De recessieve resistentie markers bleken zeer geschikt voor directe selectie van mitotische recombinanten. Ze zijn gebruikt voor het schatten van recombinatie-frequenties. Tevens is de lineaire volgorde van enkele markers op chromosoom VI bepaald aan de hand van direct selecteerbare overkruisingsprodukten. Enkele nitraatreductase mutaties zijn door transformatie met het A.nigernia D +gen gecomplementeerd. Van tien transformanten is de mitotische stabiliteit bepaald, en enkele zijn moleculair nader geanalyseerd.Hoofdstuk 4 beschrijft de genetische analyse van amd S transformanten van A.niger . Het A.nidulans amd S gen (coderend voor een aceetamidase) is door transformatie geintroduceerd in A.niger . De transformerende sequentie bleek in elk van de twaalf geanalyseerde transformanten in één koppelingsgroep geïntegreerd te zijn, waarschijnlijk in elke transformant op een unieke plaats. In totaal is op zeven van de acht chromosomen een amd S insertie gevonden. Onze (niet getransformeerde) A.niger stammen groeien niet op aceetamide en zijn minder gevoelig voor fluor-aceetamide dan de transformanten. Hierdoor is het mogelijk om naar twee kanten te selecteren: transformanten kunnen worden geselecteerd als groeiers op aceetamide, terwijl verlies van het AmdS +fenotype leidt tot fluoro-aceetamide resistentie. Diploiden die ontstaan zijn uit een transformant en een niet- transformant zijn hemizygoot voor de amd S insertie en zijn fenotypisch Amd +. De mitotische stabiliteit van het Amd +fenotype van transformanten en hemizygote diploiden is gekwantificeerd. De positie van het geïntegreerde plasmide ten opzichte van andere markers op het chromosoom bleek eenvoudig te bepalen.In hoofdstuk 5 is een genetische kaart van A.niger beschreven. Voor het bepalen van de ligging van 60 markers ten opzichte van het centromeer op de acht chromosomen is voornamelijk gebruik gemaakt van de genetische markers en technieken die in de hoofdstukken 2,3 en 4 beschreven zijn. Tevens is voor de genetische analyses gebruik gemaakt van amd S transformanten. Daartoe is de vermoedelijke positie van de amd S insertie van negen transformanten bepaald. In de meeste gevallen bleek de amd S marker distaal van de andere markers te liggen. Daardoor zijn de amd S transformanten zeer geschikt voor het in kaart brengen van (niet selecteerbare) recessieve markers omdat ze aan de volgende eisen voldoen:(1) Amd S transformanten zijn betrekkelijk eenvoudig te isoleren.(2) In hemizygote diploiden kan geselecteerd worden op recombinanten die de amd S marker kwijt zijn geraakt. De frequentie waarmee dergelijke recombinanten door overkruising ontstaan is afhankelijk van de relatieve afstand van de amd S marker tot het centromeer.(3) De analyse van recombinanten is eenvoudig: het genotype kan direct van het fenotype worden afgeleid.(4) De amd S marker kan op vele plaatsen in het genoom worden geïntegreerd, zodat in principe voor elke chromosoomarm een transformant met een distaal gelegen amd S marker kan worden verkregen.In hoofdstuk 6 is een electroforetisch karyotype van A. niger beschreven. Met behulp van 'pulsed-field' gel electroforese zijn de chromosomen van A.niger in vier banden gescheiden. Zeven van de acht koppelingsgroepen konden worden toegekend aan een specifieke chromosomale band. Hiervoor zijn zeven transformanten gebruikt die elk op een ander chromosoom de amd S marker dragen. De grootte van de chromosomen is geschat en varieert van 3,5 tot 6,6 megabasen. Electroforetische karyotypering is toegepast voor het idealiseren van A genen en voor het schatten van de grootte van de insertie bij een transformant met vele copien van het amd S plasmide.Hoofdstuk 7 tenslotte bevat een samenvatting en een algemene discussie.