Evolución de la resistencia antibiótica de Pseudomonas aeruginosa en infecciones respiratorias crónicas y su relación con la hipermutabilidad

Evolución de la resistencia antibiótica de Pseudomonas aeruginosa en infecciones respiratorias crónicas y su relación con la hipermutabilidad

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020

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Main Author: Colque, Claudia Antonella
Other Authors: Smania, Andrea María
Format: doctoralThesis biblioteca
Language:spa
Subjects:Pseudomonas aeruginosa, Enfermedades respiratorias, Mutagénesis, Genética bacteriana, Biofilmes,
Online Access:http://hdl.handle.net/11086/17228
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spelling dig-unc-ar-11086-172282021-02-04T05:02:08Z Evolución de la resistencia antibiótica de Pseudomonas aeruginosa en infecciones respiratorias crónicas y su relación con la hipermutabilidad Colque, Claudia Antonella Smania, Andrea María Sola, Claudia del Valle Becerra, María Cecilia Saka, Héctor Alex Power, Pablo Pseudomonas aeruginosa Enfermedades respiratorias Mutagénesis Genética bacteriana Biofilmes Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020 Pseudomonas aeruginosa es capaz de explotar mecanismos de resistencia intrínsecos y adquiridos para resistir a casi todos los antibióticos actualmente utilizados. Se ha propuesto que la resistencia mediada por mutaciones puede verse estimulada por la presencia de cepas hipermutadoras, las cuales presentan tasas de mutación incrementadas debido a deficiencias en los sistemas de reparación de ADN. En bacterias, la mutagénesis representa uno de los mecanismos principales involucrados en la generación de variabilidad genética, por lo que el control y ajuste de la tasa de mutación resultan fundamentales para la optimización de procesos adaptativos. Las infecciones respiratorias crónicas producidas por P. aeruginosa en pacientes con fibrosis quística (FQ) constituyen un excelente modelo natural para estudiar evolución bacteriana, en el que las células hipermutadoras prevalecen a una frecuencia significativamente mayor a las encontradas en otro tipo de infecciones o en el ambiente, incrementando los desafíos terapéuticos para combatirlas. Durante el transcurso de vida de un paciente con FQ, se administra una amplia batería de antibióticos tendientes a combatir las infecciones bacterianas, sin embargo, como contrapartida, los mismos ejercen una presión de selección que promueve la generación de resistencia y la consecuente adaptación y persistencia de la bacteria. Existe un gran interés y se han logrado grandes avances para entender los mecanismos mutacionales que generan resistencia en P. aeruginosa. Sin embargo, hasta el momento no se ha estudiado la implicancia de la diversidad genética poblacional en la resistencia bacteriana ni tampoco su evolución in vivo a largo plazo en un mismo paciente, en el que sea posible considerar el efecto de altas tasas de mutación bacteriana y el tratamiento antibiótico recibido. El presente trabajo de tesis tuvo como primer objetivo estudiar la evolución del resistoma mutacional de un linaje hipermutador de P. aeruginosa combinando un análisis longitudinal y transversal de aislados clínicos colectados de un paciente FQ, a lo largo de 20 años de infección crónica. Como segundo objetivo, el trabajo estuvo abocado a investigar la evolución de la enzima β-lactamasa AmpC, considerada el principal mecanismo de resistencia a antibióticos β-lactámicos en P. aeruginosa. Este último objetivo se abordó a través de una caracterización a nivel fenotípico, molecular y estructural de AmpC en poblaciones bacterianas del mismo linaje hipermutador de P. aeruginosa abarcando ahora un período de 26 años de infección crónica. Finalmente se indagó en la diversidad genética de ampC en poblaciones de P. aeruginosa obtenidas a partir de una cohorte de 24 pacientes adultos FQ lo que permitió asimismo investigar la asociación entre la mutagénesis en este gen y el fenotipo hipermutador en el contexto de las infecciones pulmonares crónicas. Los resultados obtenidos demuestran que en la historia evolutiva del linaje hipermutador bajo estudio, signada por una selección negativa y acumulación de miles de mutaciones a nivel del genoma global, particularmente aquellas mutaciones acumuladas en los genes de resistencia fueron seleccionadas positivamente en directa correlación con la fuerte presión ejercida por el tratamiento con antibióticos. Durante el progreso de la infección, el linaje bacteriano mostró un incremento progresivo de la resistencia antibiótica, configurándose poblaciones genotípicamente diversas en las que sublinajes coexistentes convergieron a un perfil de multiresistencia (MDR). Dichos sublinajes emergieron por evolución paralela a través de diferentes vías evolutivas que afectaron genes de las mismas categorías funcionales. De manera interesante, ampC y ftsI, que codifican para la β-lactamasa AmpC y la proteína de unión a penicilina PBP-3, respectivamente, estuvieron dentro de los genes más frecuentemente mutados. De hecho, ambos genes fueron objeto de múltiples eventos mutacionales, los cuales dieron lugar a la coexistencia de alelos altamente diversos que podrían constituir la base de los niveles de resistencia a β-lactámicos en los aislados clínicos del paciente. Esta observación motivó el estudio de la evolución de AmpC, lográndose evidenciar que las variantes ampC evolucionadas confieren elevados niveles de resistencia a una batería de antibióticos β-lactámicos incluyendo la cefalosporina de 5ta generación ceftolozano, a la cual la población bacteriana nunca estuvo expuesta. Asimismo, los estudios de cinética-enzimática demostraron que las distintas variantes AmpC poseen una eficiencia catalítica mejorada, fundamentalmente hacia cefalosporinas incluyendo ceftolozano. Por su parte, los estudios de simulación por dinámica molecular arrojaron resultados sobre modificaciones estructurales claves en la enzima que permitirían una ampliación de la entrada al bolsillo de unión a sustrato, favoreciendo el correcto acomodamiento de cefalosporinas y monobactámicos con cadenas laterales R1 más voluminosas. Los estudios en poblaciones de aislados de P. aeruginosa obtenidos de diferentes pacientes con FQ confirmaron el rol fundamental de las mutaciones específicas en ampC analizadas en este trabajo, determinado por su alta frecuencia de emergencia y selección. Por último, los resultados permitieron determinar una correlación significativa entre el número de mutaciones en ampC y el fenotipo hipermutador, aportando evidencias que permiten por primera vez asociar la hipermutabilidad con mutaciones adaptativas in vivo. En conclusión, los resultados obtenidos en el presente trabajo de tesis demuestran cómo la dinámica del tratamiento antibiótico que recibe un paciente con FQ constituye una fuerza selectiva que conduce a la adaptación de P. aeruginosa hacia un perfil MDR. En un contexto de altas presiones selectivas, las cepas hipermutadoras, además de impulsar la evolución de la resistencia antibiótica a través de la mutación simultánea de varios genes, favorece la emergencia de alelos adaptativos novedosos agrupando mutaciones beneficiosas y/o compensatorias en un mismo gen, que en el caso particular del tratamiento con β-lactámicos implica mutaciones repetidas en el gen ampC, expandiendo así las estrategias de persistencia de P. aeruginosa 2022-11-30 Fil: Colque, Claudia Antonella. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Fil: Smania, Andrea María. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Smania, Andrea María. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Sola, Claudia Del Valle. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Fil: Sola, Claudia Del Valle. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigación en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Becerra, María Cecilia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacia; Argentina. Fil: Becerra, María Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; Argentina. Fil: Saka, Héctor Alex. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Saka, Héctor Alex. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica e Inmunología; Argentina. Fil: Power, Pablo. Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Microbiología, Inmunología y Biotecnología; Argentina. Fil: Power, Pablo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. 2021-02-02T18:56:42Z 2020-12-01 doctoralThesis http://hdl.handle.net/11086/17228 spa Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

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