Uma quitinase termoestável de chromobacterium violaceum atcc 12472 expressa em escherichia coli e que inibe a germinação de conídios de dois fungos fitopatogênicos isolados do abacaxi ornamental.
Chromobacterium violaceum é uma β-proteobactéria Gram-negativa, saprófita, anaeróbia facultativa e de vida livre. Essa bactéria habita vários ecossistemas nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, principalmente em amostras de água ou de solo úmido. Ela caracteriza-se também por possuir um versátil metabolismo energético, fazendo uso de inúmeras enzimas que possibilitam a utilização de variadas fontes de energia. No genoma da C. violaceum foram identificadas diversas ORFs (open reading frames), codificando proteínas supostamente responsáveis por mediar a interação de C. violaceum com os vários elementos presentes nos ambientes em que ela habita. Entre estas proteínas, estão várias quitinases. Quitinases são enzimas capazes de hidrolisar a quitina, que é um polissacarídeo composto por resíduos de N-acetil-β-D-glucosamina unidos por ligações O-glicosídicas do tipo β- (1,4). Neste trabalho, o objetivo foi expressar uma quitinase (CV1440) de C. violaceum ATCC 12472 em E. coli, purificar a proteína recombinante e caracterizá-la em relação a aspectos bioquímicos e biológicos. A sequência codificada pela ORF CV1440 foi amplificada por reação em cadeia da DNA polimerase (PCR) e adicionada ao cassete de expressão do plasmídeo pET303/CT-His. O plasmídeo recombinante foi clonado em E. coli TOP10F' e posteriormente introduzido em E. coli BL21(DE3) para expressão. A proteína recombinante foi secretada para o meio de cultura, via peptídeo sinal endógeno. A quitinase foi então purificada a partir do meio livre de células por precipitação com sulfato de amônio (95% de saturação), cromatografia de afinidade a quitina, seguida de uma cromatografia de afinidade a níquel imobilizado em matriz de Sepharose. Quando submetida a eletroforese em condições desnaturantes (SDS- PAGE), a proteína purificada apresentou uma única banda com massa molecular aparente de cerca de 46 kDa. A identidade dessa banda como correspondendo à quitinase CV1440 foi confirmada por espectromeria de massas. O rendimento do produto recombinante purificado foi de aproximadamente 3 mg por litro de cultura. A quitinase recombinante purificada apresentou atividade ótima em pH 5,0, e apresentou uma temperatura ótima de 60 oC, foi moderadamente estavel a variação de pH e elevadamente estavel a variações de temperatura, mantendo mais de 50% da atividade quitinolítica após incubação a 100 oC por 1 hora. A atividade da enzima foi afetada negativamente pelos íons Cu+2, Hg+2, La+3 e Fe+2 e pelos agentes químicos DTT, β-mercaptoetanol, e SDS, porém não houve aumento de atividade na presença de outros íons, bem como, na presença do quelante EDTA, sugerindo que a enzima não possui cofator. A enzima conseguiu inibir a germinação de conídios dos fungos fitopatogênicos Fusarium oxysporum e F. proliferatum. Ensaios de microscopia de força atômica revelaram alterações mORFológicas pronunciadas na superfície de esporos incubados com CvChi47 quando comparados aos conídios não tratados com a enzima. Juntos, esses resultados indicam a possibilidade de utilização futura da quitinase codificada pela ORF CV1440 como uma potencial ferramenta no controle de fungos fitopatogênicos.
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2018-12-19
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Online Access: | http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/handle/doc/1102116 |
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dig-alice-doc-11021162018-12-21T23:42:47Z Uma quitinase termoestável de chromobacterium violaceum atcc 12472 expressa em escherichia coli e que inibe a germinação de conídios de dois fungos fitopatogênicos isolados do abacaxi ornamental. SOUSA, A. J. S. Antônio Juscelino Sudário Sousa, Universidade Federal do Ceará. CV1440 Escherichia Coli Fusarium Oxysporum Chromobacterium violaceum Fusarium proliferatum Atomic force microscopy Chromobacterium violaceum é uma β-proteobactéria Gram-negativa, saprófita, anaeróbia facultativa e de vida livre. Essa bactéria habita vários ecossistemas nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, principalmente em amostras de água ou de solo úmido. Ela caracteriza-se também por possuir um versátil metabolismo energético, fazendo uso de inúmeras enzimas que possibilitam a utilização de variadas fontes de energia. No genoma da C. violaceum foram identificadas diversas ORFs (open reading frames), codificando proteínas supostamente responsáveis por mediar a interação de C. violaceum com os vários elementos presentes nos ambientes em que ela habita. Entre estas proteínas, estão várias quitinases. Quitinases são enzimas capazes de hidrolisar a quitina, que é um polissacarídeo composto por resíduos de N-acetil-β-D-glucosamina unidos por ligações O-glicosídicas do tipo β- (1,4). Neste trabalho, o objetivo foi expressar uma quitinase (CV1440) de C. violaceum ATCC 12472 em E. coli, purificar a proteína recombinante e caracterizá-la em relação a aspectos bioquímicos e biológicos. A sequência codificada pela ORF CV1440 foi amplificada por reação em cadeia da DNA polimerase (PCR) e adicionada ao cassete de expressão do plasmídeo pET303/CT-His. O plasmídeo recombinante foi clonado em E. coli TOP10F' e posteriormente introduzido em E. coli BL21(DE3) para expressão. A proteína recombinante foi secretada para o meio de cultura, via peptídeo sinal endógeno. A quitinase foi então purificada a partir do meio livre de células por precipitação com sulfato de amônio (95% de saturação), cromatografia de afinidade a quitina, seguida de uma cromatografia de afinidade a níquel imobilizado em matriz de Sepharose. Quando submetida a eletroforese em condições desnaturantes (SDS- PAGE), a proteína purificada apresentou uma única banda com massa molecular aparente de cerca de 46 kDa. A identidade dessa banda como correspondendo à quitinase CV1440 foi confirmada por espectromeria de massas. O rendimento do produto recombinante purificado foi de aproximadamente 3 mg por litro de cultura. A quitinase recombinante purificada apresentou atividade ótima em pH 5,0, e apresentou uma temperatura ótima de 60 oC, foi moderadamente estavel a variação de pH e elevadamente estavel a variações de temperatura, mantendo mais de 50% da atividade quitinolítica após incubação a 100 oC por 1 hora. A atividade da enzima foi afetada negativamente pelos íons Cu+2, Hg+2, La+3 e Fe+2 e pelos agentes químicos DTT, β-mercaptoetanol, e SDS, porém não houve aumento de atividade na presença de outros íons, bem como, na presença do quelante EDTA, sugerindo que a enzima não possui cofator. A enzima conseguiu inibir a germinação de conídios dos fungos fitopatogênicos Fusarium oxysporum e F. proliferatum. Ensaios de microscopia de força atômica revelaram alterações mORFológicas pronunciadas na superfície de esporos incubados com CvChi47 quando comparados aos conídios não tratados com a enzima. Juntos, esses resultados indicam a possibilidade de utilização futura da quitinase codificada pela ORF CV1440 como uma potencial ferramenta no controle de fungos fitopatogênicos. Tese (Doutorado em Bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza. Orientador: Thalles Barbosa Grangeiro. 2018-12-21T23:42:43Z 2018-12-21T23:42:43Z 2018-12-19 2018 2019-01-30T11:11:11Z Teses 2018 http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/handle/doc/1102116 pt_BR por openAccess 113 p. |
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Chromobacterium violaceum é uma β-proteobactéria Gram-negativa, saprófita, anaeróbia facultativa e de vida livre. Essa bactéria habita vários ecossistemas nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, principalmente em amostras de água ou de solo úmido. Ela caracteriza-se também por possuir um versátil metabolismo energético, fazendo uso de inúmeras enzimas que possibilitam a utilização de variadas fontes de energia. No genoma da C. violaceum foram identificadas diversas ORFs (open reading frames), codificando proteínas supostamente responsáveis por mediar a interação de C. violaceum com os vários elementos presentes nos ambientes em que ela habita. Entre estas proteínas, estão várias quitinases. Quitinases são enzimas capazes de hidrolisar a quitina, que é um polissacarídeo composto por resíduos de N-acetil-β-D-glucosamina unidos por ligações O-glicosídicas do tipo β- (1,4). Neste trabalho, o objetivo foi expressar uma quitinase (CV1440) de C. violaceum ATCC 12472 em E. coli, purificar a proteína recombinante e caracterizá-la em relação a aspectos bioquímicos e biológicos. A sequência codificada pela ORF CV1440 foi amplificada por reação em cadeia da DNA polimerase (PCR) e adicionada ao cassete de expressão do plasmídeo pET303/CT-His. O plasmídeo recombinante foi clonado em E. coli TOP10F' e posteriormente introduzido em E. coli BL21(DE3) para expressão. A proteína recombinante foi secretada para o meio de cultura, via peptídeo sinal endógeno. A quitinase foi então purificada a partir do meio livre de células por precipitação com sulfato de amônio (95% de saturação), cromatografia de afinidade a quitina, seguida de uma cromatografia de afinidade a níquel imobilizado em matriz de Sepharose. Quando submetida a eletroforese em condições desnaturantes (SDS- PAGE), a proteína purificada apresentou uma única banda com massa molecular aparente de cerca de 46 kDa. A identidade dessa banda como correspondendo à quitinase CV1440 foi confirmada por espectromeria de massas. O rendimento do produto recombinante purificado foi de aproximadamente 3 mg por litro de cultura. A quitinase recombinante purificada apresentou atividade ótima em pH 5,0, e apresentou uma temperatura ótima de 60 oC, foi moderadamente estavel a variação de pH e elevadamente estavel a variações de temperatura, mantendo mais de 50% da atividade quitinolítica após incubação a 100 oC por 1 hora. A atividade da enzima foi afetada negativamente pelos íons Cu+2, Hg+2, La+3 e Fe+2 e pelos agentes químicos DTT, β-mercaptoetanol, e SDS, porém não houve aumento de atividade na presença de outros íons, bem como, na presença do quelante EDTA, sugerindo que a enzima não possui cofator. A enzima conseguiu inibir a germinação de conídios dos fungos fitopatogênicos Fusarium oxysporum e F. proliferatum. Ensaios de microscopia de força atômica revelaram alterações mORFológicas pronunciadas na superfície de esporos incubados com CvChi47 quando comparados aos conídios não tratados com a enzima. Juntos, esses resultados indicam a possibilidade de utilização futura da quitinase codificada pela ORF CV1440 como uma potencial ferramenta no controle de fungos fitopatogênicos. |
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