The influence of different methods of frozen-thawed ovine spermatozoa selection on sperm capacitation and viability after incubation.

Abstract: Sperm capacitation is an essential event for fertilization; however, it decreases the sperm lifespan and viability. The aim of this study was to evaluate the effects of four sperm selection techniques on sperm capacitation and viability after incubation. A pool of frozen-thawed sperm from 10 Santa Inês rams was used. The samples were submitted to one of the following sperm selection techniques: sperm washing, Percoll gradient, mini-Percoll gradient, Swim-up and control group. At mini-Percoll technique, was used 400 microliters of 90% and 45% gradients and a centrifugation at 500 xg for 5 minutes. In Percoll, was used 1 mL of each gradient and a centrifugation at 700 xg for 10 minutos. During Swim-up, the sperm was incubated in 1 ml of SPERM-TALP for 45 minutos in humidified atmosphere at 37.5oC. Finaly, at sperm washing the sample suffered centrifugation at 300 xg for 8 minutes, using SPERM-TALP. At the end of each treatment, the selected spermatozoa were incubated at 37oC for 1 h, 2 h, and 3 h. Viability was assessed using acridine orange-propidium iodide combination by computer-assisted sperm analysis. Capacitation status was evaluated using chlortetracycline staining and observed under epifluorescence microscopy. Data were analyzed by ANOVA, followed by Tukey test (P<0.05). After 3 h of incubation, the capacitated sperm was decreased (P<0.05) in all treatments. The capacitated sperm rate was similar (P>0.05) among Percoll (36%), mini-Percoll (34%) and Swim-up (30%), and were lower (P<0.05) than control group (47%) and sperm washing (41%), regardless of the time of incubation. The non-capacitated sperm percentage was higher (P<0.05) at 0 h (12%) and decreased after 3 h (1.5%), in all treatments. Regarding to acrosome reacted cells, there was an interaction (P<0.05) between incubation and sperm selection treatment. The acrosome reacted spermatozoa showed a lower percentage (P<0.05) at 0 h (50%) and 1 h (53%) and higher after 3 h (64%). Percoll and mini-Percoll were higher about acrosome reacted spermatozoa (P<0.05; 60% vs. 61%), whereas control group was the lowest (49%). There was an interaction (P<0.05) between incubation and treatment in sperm viability. Viability assays revealed that 0 h resulted in a higher rate (17.5%; P<0.05) of membrane integrity, after all treatments. Swim-up treatment showed a higher membrane integrity rate (17.4%; P<0.05), regardless of time of incubation. In conclusion, the incubation affects the capacitation status and viability of frozen-thawed ovine sperm. Sperm selection increases the acrosome reacted cells rate and Swim-up allows better viability during incubation. [Influência de diferentes métodos de seleção de espermatozoides ovinos congelados sobre a capacitação e vitalidade espermática após incubação]. Resumo: Apesar de necessária para a fecundação, a capacitação espermática diminui a longevidade e vitalidade dos espermatozoides. Objetivou-se analisar os efeitos de quatro métodos de seleção espermática sobre a capacitação e vitalidade dos espermatozoides após incubação. Foi utilizado pool de sêmen congelado comercial de 10 carneiros da raça Santa Inês. As amostras foram submetidas aos diferentes métodos de seleção: lavagem por centrifugação, gradiente de Percoll, mini-Percoll, Swim-up e grupo controle. Na técnica de mini-Percoll, foi utilizado 400 microlitros dos gradientes de 90% e 45% e a amostra foi submetida a centrifugação por 5 minutos a 5000 xg. Para a técnica de Percoll, foi utilizado 1 mL de cada gradiente e os espermatozoides foram submetidos à força de 700 xg por 10 minutos. Durante o Swim-up, os espermatozoides foram incubados em 1 mL de SPERM-TALP por 45 minutos em atmosfera humidificada a 37,5oC. Já na lavagem por centrifugação, a amostra foi submetida a centrifugação por 8 minutos a 300 x g em SPERM-TALP. Posteriormente, os espermatozoides selecionados foram incubados a 37º C por 1 h, 2 h e 3 h. Foi avaliada a vitalidade por meio de iodedo de propídeo e laranja de acridina pelo sistema de avaliação seminal computadorizada. A capacitação espermática foi analisada pela coloração de hidroclorido de clortetraciclina em microscópio de epifluorescência. O efeito do método sobre os parâmetros foi avaliado pela ANOVA, seguido pelo teste de Tukey (P<0,05). Após 3 h, houve decréscimo da taxa de espermatozoides capacitados (P<0,05) em todos os métodos de seleção. Independente do momento de incubação, a taxa de capacitados foi similar (P>0,05) entre Percoll (36%), mini-Percoll (34%) e Swim-up (30%), as quais foram inferiores (P<0,05) ao grupo controle (47%) e lavagem por centrifugação (41%). A taxa de espermatozoides não capacitados foi superior (P<0,05) no momento 0 h (12%) e diminuiu após 3 h (1,5%), independentemente do método. Houve interação (P<0,05) entre intervalo de incubação e método na taxa de espermatozoides reagidos. O índice de reagidos foi menor (P<0,05) em 0 h (50%) e 1 h (53%) e maior após 3 h (64%). Percoll (60%) e mini-Percoll (61%) apresentaram maiores valores para reagidos (P<0,05) enquanto o controle apresentou o menor (49%). Observou-se interação (P<0,05) entre intervalo de incubação e método na vitalidade espermática. A taxa de íntegros em 0 h foi a maior (17,5%; P<0,05), após os diferentes métodos. O Swim-up apresentou maior taxa de íntegros (17,4%; P<0,05), independentemente do intervalo de incubação. Em conclusão, o intervalo de incubação interfere nos padrões de capacitação e vitalidade de espermatozoides ovinos congelados. A seleção espermática aumenta a taxa de células reagidas e o Swim-up permite maior vitalidade durante a incubação.

Bibliographic Details

Main Authors:	OLIVARES, C. C. S., SOUZA-FABJAN, J. M. G., PENEIRAS, A. B. V., BALARO, M. F. A., FREITAS, V. J. F., FONSECA, J. F. da, BRANDÃO, F. Z.
Other Authors:	Universidade Federal Fluminense (UFF); Universidade Estadual do Ceará (UECe) - Fortaleza, CE.; JEFERSON FERREIRA DA FONSECA, CNPC.
Format:	Anais e Proceedings de eventos biblioteca
Language:	English eng
Published:	2017-08-25
Subjects:	Longevidade espermática, Seleção espermática, Raça Santa Inês, Sperm longevity, Sperm selection, Embryo Technology., Ovino, Carneiro, Reprodução animal, Transferência de Embrião, Sêmen, Espermatozóide, Sheep, Reproduction, Rams.,
Online Access:	http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/handle/doc/1074502
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